论文部分内容阅读
目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是常见的神经退行性疾病,黑质（Substantia nigra,SN）多巴胺能神经元选择性缺失是其主要的病理特征。PD病因和机制目前还不清楚,SN铁沉积是PD发病的关键因素。铁在中枢神经系统中发挥着重要作用,包括髓鞘磷脂产生、线粒体呼吸、神经递质与DNA合成等。当铁在细胞和组织中过量存在时,会破坏氧化还原稳态并催化活性氧的过多产生,导致氧化应激。在中枢神经系统中,少突胶质细胞是脑内铁含量最多的细胞,其形成髓鞘需要充足的铁。有研究表明少突胶质细胞对氧化应激非常敏感,铁过载更容易引起少突胶质细胞的损伤,PD患者在大脑有脱髓鞘的改变。然而铁过载对少突胶质细胞的损伤作用及其机制目前尚不清楚。本实验旨在探讨枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）对MO3.13少突胶质细胞的损伤作用及其机制。方法:应用Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂盒检测MO3.13少突胶质细胞的活力,应用免疫印迹法检测细胞内铁死亡相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的变化,应用流式细胞术检测细胞活性氧水平,应用铁试剂盒检测细胞内铁含量的变化,应用透射电子显微镜观察细胞器形态的变化。结果:（一）FAC对未分化的MO3.13少突胶质细胞的损伤1.CCK8检测不同浓度的FAC对未分化的MO3.13少突胶质细胞细胞活力的影响。20 mg/L,50 mg/L,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L,1000 mg/L,2000 mg/L的FAC处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,在20 mg/L,50 mg/L,100 mg/L浓度下细胞活力没有明显变化,在200 mg/L,500 mg/L,1000 mg/L,2000 mg/L浓度下细胞活力下降明显（P＜0.001）。本实验选用了100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L三个FAC浓度进行后续实验。2.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组总铁浓度升高（P＜0.001）,500 mg/L FAC处理组与100 mg/L FAC处理组和200 mg/L FAC处理组相比总铁浓度升高（P＜0.001）。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组二价铁浓度升高（P＜0.001）,500 mg/L FAC处理组与100 mg/L FAC处理组和200 mg/L FAC处理组相比二价铁浓度升高（P＜0.001,P＜0.01）。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组三价铁浓度升高（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001）,500 mg/L FAC处理组与100 mg/L FAC处理组和200 mg/L FAC处理组相比三价铁浓度升高（P＜0.001）。3.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC和20μmol/L erastin处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,铁死亡诱导剂erastin作为阳性对照。与对照组相比,100mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组以及铁死亡诱导剂erastin组谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达明显下降（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.001）。4.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC和20μmol/L erastin处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与对照组相比,细胞内活性氧明显增多（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.001,P＜0.01）。5.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC和20μmol/L erastin处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,细胞内线粒体出现了不同程度上的膜密度增高,线粒体嵴减少。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC和erastin组线粒体长度变小（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001）。与100 mg/L FAC处理组相比,200mg/L,500 mg/L FAC和erastin组线粒体长度变小（P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01）。6.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC和100 nmol/L staurosporine处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,staurosporine是凋亡的诱导剂,作为阳性对照。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组Bcl-2/Bax和cleaved caspase-3表达无明显的变化。与对照组相比,staurosporine处理组cleaved caspase-3的表达明显上升（P＜0.001）。7.200μmol/L的铁螯合剂去铁胺（Deferoxamine,DFO）预处理未分化的MO3.13少突胶质细胞1小时再分别加入100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC共同作用于未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与单纯FAC处理组相比,DFO预处理后与FAC共孵育组GPX4表达增加（P＜0.05）。8.10μmol/L的铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）预处理未分化的MO3.13少突胶质细胞1小时再分别加入100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC共同作用于未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与单纯FAC处理组相比,Fer-1预处理后与FAC共孵育组GPX4表达增加（P＜0.05）。9.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理未分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组p53的磷酸化水平无明显的变化。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组细胞外信号调节激酶1和2（Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2,Erk1/2）磷酸化水平明显的上升（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001）,与100 mg/L FAC处理组相比,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组Erk1/2磷酸化水平明显的上升（P＜0.05）。（二）FAC对分化的MO3.13少突胶质细胞的损伤1.用4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯处理未分化的MO3.13少突胶质细胞7天后分化为成熟的少突胶质细胞,然后100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L FAC处理分化的MO3.13少突胶质细胞GPX4无明显变化,但500mg/L的FAC处理组GPX4表达下降（P＜0.01）。2.100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC分别处理分化的MO3.13少突胶质细胞24小时,与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L,500 mg/L FAC处理组Bax/Bcl-2无明显的变化。与对照组相比,100 mg/L,200 mg/L FAC处理分化的MO3.13少突胶质细胞,cleaved caspase-3的表达没有变化,但500 mg/L FAC处理分化的MO3.13少突胶质细胞,cleaved caspase-3的表达降低（P＜0.05）。结论:铁过载导致少突胶质细胞出现铁死亡但不引起凋亡,铁离子螯合剂DFO和铁死亡抑制剂Fer-1可以拮抗铁过载导致的少突胶质细胞铁死亡,铁过载引起少突胶质细胞铁死亡的机制可能与丝裂原活化蛋白激酶通路激活有关而非p53通路激活所致。本研究为了解铁过载导致少突胶质细胞损伤机制提供了可靠的实验依据并为PD脱髓鞘的治疗提供了新的思路。