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骨肉瘤是目前儿童和青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤，其恶性程度高、预后差，严重威胁着人类的生命健康[1-5]。在小于24岁患者的发病率在全球范围内基本一致，骨肉瘤患者男女比例约为1.40：1，在男性中比在女性中更常见[6]。在1970年之前，骨肉瘤的治疗主要取决于手术切除，缺乏其他辅助治疗手段，导致患者5年生存率普遍低于20％[7]。随着有效化疗药物的引入使用，以及新辅助化疗等辅助治疗手段的后续发展，骨肉瘤患者的预后也逐渐得到改善，到上世纪90年代，患者的5年生存率增加至70%左右[8]。目前，用于治疗骨肉瘤的标准化疗方案组合为多柔比星、甲氨蝶呤加上顺铂等新辅助化疗组合[9-13]。即使有了这些干预措施，近20年患者的治疗效果进展却并不明显。有研究表明，目前骨肉瘤患者的复发率仍高达约35％，转移性疾病患者五年总生存率仅约为10-30％，而出现化疗耐药的患者的预后很差[14-17]。而且，化疗严重的副作用限制了化疗药物在治疗上的使用，这些副作用包括不同程度的骨髓抑制、严重的肝毒性、心脏毒性、肾毒性以及严重的胃肠道反应[18-20]。骨肉瘤患者的临床治疗结果在近年来没有得到显著改善[21]。可见，骨肉瘤的治疗依然面临巨大挑战，因此有必要研发新的高效化疗药物。
吴茱萸碱是一种吲哚喹诺酮类生物碱，是从传统中药材吴茱萸果实中分离得到的主要成分之一[22]，其已被证明具有多种生物活性，包括抗炎、抗肥胖、抗心血管疾病[23-25]。此外，现有多项研究证据表明吴茱萸碱具有强大而广泛的抗肿瘤活性，包括结肠癌细胞，黑色素瘤细胞，白血病T淋巴细胞、乳腺癌细胞和前列腺癌细胞等[26-28]。令人兴奋的是，目前已有长春新碱等多个吲哚类生物碱抗肿瘤药物进入临床应用，取得较好的临床治疗效果[29,30]；吴茱萸碱作为该类生物碱之一，其抗肿瘤潜在价值得重视。
本研究通过吴茱萸碱作用于人骨肉瘤HOS细胞株，以人正常成骨细胞hFOB1.19作为正常对照，利用多项体外实验，探讨吴茱萸碱在体外对HOS细胞潜在的作用机制，为吴茱萸碱治疗骨肉瘤的可能性提供新的理论依据。
研究目的
通过多项体外实验来观察吴茱萸碱对人骨肉瘤增殖、凋亡及细胞周期的影响，探讨吴茱萸碱在HOS细胞株中潜在的抗肿瘤机制，发掘其抗人骨肉瘤的潜在价值。
实验方法
1.利用CCK-8法检测吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞以及人正常成骨细胞hFOB1.19细胞活力的影响。
2.通过集落形成实验观察吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞增殖能力的影响。
3.利用AO/EB双染法观察吴茱萸碱作用后对HOS细胞凋亡形态变化。
4.使用Hoechst染色法观察吴茱萸碱作用后HOS细胞的凋亡细胞核形态的变化。
5.利用流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的凋亡率。
6.利用流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞株细胞周期的变化。
7.通过蛋白免疫印迹法检测吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞Caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K表达量的影响。
实验结果
1.吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞株和人正常成骨细胞hFOB1.19细胞活力的影响
吴茱萸碱处理细胞后，CCK-8法检测HOS细胞和hFOB1.19细胞的细胞活力。结果显示：吴茱萸碱0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM作用于两种细胞，与对照组(0μM)相比较，药物浓度在2-16μM浓度梯度作用24、48、72h，吴茱萸碱可明显抑制HOS细胞增殖。而在1-8μM的药物浓度作用24-48h后，吴茱萸碱对hFOB1.19细胞增殖的抑制作用均不显著；在8μM药物浓度下作用72h才出现较明显的抑制作用。以上结果表明：随着培养体系中药物浓度的增加以及处理时间的延长，HOS细胞的细胞存活率地逐渐下降；在2-8μM的药物浓度下，对HOS细胞的体外增值能力有明显抑制作用，这种抑制作用表现出剂量-时间依赖性效应；同时，其对人正常成骨细胞的毒副作用相对较低。
2.集落形成试验观察吴茱萸碱对HOS细胞增殖能力的影响
用六孔板接种细胞并用吴茱萸碱处理后，观察细胞体外增值能力，结果显示：对照组肉眼可见大量紫色细胞集落，部分融合成片；与对照组相比较，各个药物处理组形成的集落数量明显减少，分布稀疏；随着药物浓度增加，肉眼可见的细胞集落逐渐减少。该结果与CCK-8检测结果一致，表明相应浓度吴茱萸碱可明显抑制HOS细胞在体外的增殖能力。
3.AO/EB双染法观察吴茱萸碱处理后HOS细胞的细胞形态变化
吴茱萸碱处理HOS细胞后，利用AO/EB试剂进行双染细胞，荧光显微镜下观察到：对照组细胞核被均匀染成呈绿色，细胞核形态正常，基本全为活细胞(VN)。吴茱萸碱处理后24、48、72h后，实验组出现大量早期凋亡细胞(VA)：细胞核染色质被染成绿色，呈固缩状或者圆珠状形态，核形态不均匀；晚期凋亡细胞(NVA):核染色质为橘红色，形态呈固缩状或者圆珠状。
4.细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒染色观察细胞凋亡核形态变化
利用Hoechst-33258将吴茱萸碱处理后的HOS细胞染色，在荧光显微镜下观察到：对照组细胞的染色质被染成蓝色，着色均匀，核形态正常，无明显核固缩或碎裂，可见少数细胞着色亮度增加。吴茱萸碱处理24、48、72h后的各组细胞，出现大量着色增亮发白，呈固缩状或者碎裂状的染色质，着色不均匀，核形态各异。
5.流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的凋亡率
对照组和吴茱萸碱处理组细胞使用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒进行染色，然后流式细胞仪上机检测。结果显示：对照组凋亡率为(5.32±1.62)%；3μM吴茱萸碱处理(24、48、72h)后细胞凋亡率分别为(10.85±1.49)%、(12.47±0.59)%、(13.47±2.34)%。
6.流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的细胞周期变化。
将未经吴茱萸碱处理的对照组细胞和给药培养不同时间的处理组样品收集，用细胞周期试剂盒染色后流式细胞仪上机检测，各组的周期变化结果如下：G0/G1期：对照组(51.12±2.13)%、24h(19.17±1.02)%、48h(16.94±1.67)%、72h(11.05±1.25)%；S期：对照组(32.92±0.73)%、24h(31.00±1.42)%、48h(32.38±3.03)%、72h(29.18±2.87)%；G2/M期：对照组(16.01±2.26)%、24h(49.82±0.62)%、48h(50.6767±2.80)%、72h(59.56±1.97)%。
7.蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达量
利用Westernblot法检测吴茱萸碱处理后HOS细胞内Caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K蛋白的表达量，观察吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞内凋亡相关蛋白的表达变化情况。实验结果表明：与对照组比较，吴茱萸碱处理后HOS细胞内促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达量均有不同程度的增高；而细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低；但是PI3K/Akt通路中的关键蛋白PI3K的表达量未见明显改变。
结论
吴茱萸碱可抑制人骨肉瘤HOS细胞在体外的增殖，诱导发生G2/M期阻滞，促进细胞发生凋亡。在相同的药物浓度下，其抑制增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡的效应均呈现出时间依赖性。其诱导凋亡、抑制增殖的机制可能与上调人骨肉瘤HOS细胞内促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来实现的。PI3K的表达量无明显变化，表明在人骨肉瘤HOS细胞中，PI3K/Akt通路可能不参与吴茱萸碱诱导的凋亡相关过程的调节。
吴茱萸碱是一种吲哚喹诺酮类生物碱，是从传统中药材吴茱萸果实中分离得到的主要成分之一[22]，其已被证明具有多种生物活性，包括抗炎、抗肥胖、抗心血管疾病[23-25]。此外，现有多项研究证据表明吴茱萸碱具有强大而广泛的抗肿瘤活性，包括结肠癌细胞，黑色素瘤细胞，白血病T淋巴细胞、乳腺癌细胞和前列腺癌细胞等[26-28]。令人兴奋的是，目前已有长春新碱等多个吲哚类生物碱抗肿瘤药物进入临床应用，取得较好的临床治疗效果[29,30]；吴茱萸碱作为该类生物碱之一，其抗肿瘤潜在价值得重视。
本研究通过吴茱萸碱作用于人骨肉瘤HOS细胞株，以人正常成骨细胞hFOB1.19作为正常对照，利用多项体外实验，探讨吴茱萸碱在体外对HOS细胞潜在的作用机制，为吴茱萸碱治疗骨肉瘤的可能性提供新的理论依据。
研究目的
通过多项体外实验来观察吴茱萸碱对人骨肉瘤增殖、凋亡及细胞周期的影响，探讨吴茱萸碱在HOS细胞株中潜在的抗肿瘤机制，发掘其抗人骨肉瘤的潜在价值。
实验方法
1.利用CCK-8法检测吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞以及人正常成骨细胞hFOB1.19细胞活力的影响。
2.通过集落形成实验观察吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞增殖能力的影响。
3.利用AO/EB双染法观察吴茱萸碱作用后对HOS细胞凋亡形态变化。
4.使用Hoechst染色法观察吴茱萸碱作用后HOS细胞的凋亡细胞核形态的变化。
5.利用流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的凋亡率。
6.利用流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞株细胞周期的变化。
7.通过蛋白免疫印迹法检测吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞Caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K表达量的影响。
实验结果
1.吴茱萸碱对人骨肉瘤HOS细胞株和人正常成骨细胞hFOB1.19细胞活力的影响
吴茱萸碱处理细胞后，CCK-8法检测HOS细胞和hFOB1.19细胞的细胞活力。结果显示：吴茱萸碱0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM作用于两种细胞，与对照组(0μM)相比较，药物浓度在2-16μM浓度梯度作用24、48、72h，吴茱萸碱可明显抑制HOS细胞增殖。而在1-8μM的药物浓度作用24-48h后，吴茱萸碱对hFOB1.19细胞增殖的抑制作用均不显著；在8μM药物浓度下作用72h才出现较明显的抑制作用。以上结果表明：随着培养体系中药物浓度的增加以及处理时间的延长，HOS细胞的细胞存活率地逐渐下降；在2-8μM的药物浓度下，对HOS细胞的体外增值能力有明显抑制作用，这种抑制作用表现出剂量-时间依赖性效应；同时，其对人正常成骨细胞的毒副作用相对较低。
2.集落形成试验观察吴茱萸碱对HOS细胞增殖能力的影响
用六孔板接种细胞并用吴茱萸碱处理后，观察细胞体外增值能力，结果显示：对照组肉眼可见大量紫色细胞集落，部分融合成片；与对照组相比较，各个药物处理组形成的集落数量明显减少，分布稀疏；随着药物浓度增加，肉眼可见的细胞集落逐渐减少。该结果与CCK-8检测结果一致，表明相应浓度吴茱萸碱可明显抑制HOS细胞在体外的增殖能力。
3.AO/EB双染法观察吴茱萸碱处理后HOS细胞的细胞形态变化
吴茱萸碱处理HOS细胞后，利用AO/EB试剂进行双染细胞，荧光显微镜下观察到：对照组细胞核被均匀染成呈绿色，细胞核形态正常，基本全为活细胞(VN)。吴茱萸碱处理后24、48、72h后，实验组出现大量早期凋亡细胞(VA)：细胞核染色质被染成绿色，呈固缩状或者圆珠状形态，核形态不均匀；晚期凋亡细胞(NVA):核染色质为橘红色，形态呈固缩状或者圆珠状。
4.细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒染色观察细胞凋亡核形态变化
利用Hoechst-33258将吴茱萸碱处理后的HOS细胞染色，在荧光显微镜下观察到：对照组细胞的染色质被染成蓝色，着色均匀，核形态正常，无明显核固缩或碎裂，可见少数细胞着色亮度增加。吴茱萸碱处理24、48、72h后的各组细胞，出现大量着色增亮发白，呈固缩状或者碎裂状的染色质，着色不均匀，核形态各异。
5.流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的凋亡率
对照组和吴茱萸碱处理组细胞使用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒进行染色，然后流式细胞仪上机检测。结果显示：对照组凋亡率为(5.32±1.62)%；3μM吴茱萸碱处理(24、48、72h)后细胞凋亡率分别为(10.85±1.49)%、(12.47±0.59)%、(13.47±2.34)%。
6.流式细胞术检测吴茱萸碱处理后HOS细胞的细胞周期变化。
将未经吴茱萸碱处理的对照组细胞和给药培养不同时间的处理组样品收集，用细胞周期试剂盒染色后流式细胞仪上机检测，各组的周期变化结果如下：G0/G1期：对照组(51.12±2.13)%、24h(19.17±1.02)%、48h(16.94±1.67)%、72h(11.05±1.25)%；S期：对照组(32.92±0.73)%、24h(31.00±1.42)%、48h(32.38±3.03)%、72h(29.18±2.87)%；G2/M期：对照组(16.01±2.26)%、24h(49.82±0.62)%、48h(50.6767±2.80)%、72h(59.56±1.97)%。
7.蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达量
利用Westernblot法检测吴茱萸碱处理后HOS细胞内Caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K蛋白的表达量，观察吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞内凋亡相关蛋白的表达变化情况。实验结果表明：与对照组比较，吴茱萸碱处理后HOS细胞内促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达量均有不同程度的增高；而细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低；但是PI3K/Akt通路中的关键蛋白PI3K的表达量未见明显改变。
结论
吴茱萸碱可抑制人骨肉瘤HOS细胞在体外的增殖，诱导发生G2/M期阻滞，促进细胞发生凋亡。在相同的药物浓度下，其抑制增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡的效应均呈现出时间依赖性。其诱导凋亡、抑制增殖的机制可能与上调人骨肉瘤HOS细胞内促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来实现的。PI3K的表达量无明显变化，表明在人骨肉瘤HOS细胞中，PI3K/Akt通路可能不参与吴茱萸碱诱导的凋亡相关过程的调节。