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本文系统分析了三株不同核黄素产量B. subtilis工程菌株的代谢特征,揭示了菌株产核黄素的内在遗传机理,同时构建了一系列产核黄素B. subtilis基因工程菌,得到的主要结果如下:发现purF基因采用不同的整合方式对菌体代谢的影响有明显差异,原因在于采用双交换整合机理构建的系列工程菌中仅purF基因表达水平提高;而采用单交换整合机理构建的系列工程菌中不仅purF基因而且其下游purM、purN、purH、purD基因的表达水平皆有不同程度的提高,这些基因的编码产物可催化更多的嘌呤前体物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氢叶酸(10-Formyl-THF)进入嘌呤途径,故其对菌体代谢影响较大。从基因表达水平上揭示产核黄素工程菌的主要特点,确定了产核黄素菌株应具有的有利表型:表达增强显著的核黄素操纵子,将加强核黄素合成途径;citZ基因及副产物形成有关的基因的下调,可避免溢流代谢、减少副产物生成;采取谷氨酸脱氢酶催化的途径利用氮源(NH4+)能节约菌的能量消耗;葡萄酸支路可提供充足的核黄素合成起始物5-磷酸核酮糖;采用能量耦合效率高的aa3氧化酶来产生能量,可有效改善能量供给。以工程菌RH33和RH44为亲株,增强表达PRPP合成酶及核糖-5-磷酸异构酶可提高胞内PRPP浓度,促进PurR调控基因的表达,进而促使胞内更多的嘌呤核苷酸、谷氨酰胺、一碳单位、甘氨酸、二氧化碳和天冬氨酸等核黄素前体物合成途径加强并参与到核黄素合成途径,核黄素合成能力分别提高20%和3.4%。核黄素合成过程中,需要1分子的DARPP(长途径提供)和2分子的DHPB(短途径提供)生成1分子的核黄素。增加PRPP浓度虽然一方面加强了前体物的供给,另一方面解除了对嘌呤及甘氨酸合成途径等PurR调控基因的抑制,但这两方面作用仅仅在于提高GTP合成途径(长途径)的通量,没有缓解存在的前体物供给不平衡,RH44对此尤为敏感。为平衡前体物供给以提高核黄素生产,在RH44中增强表达3,4-二羟基磷酸丁酮(DHPB)合成酶以增加DHPB供给,缓解存在的前体物供给不平衡,从而构建RH44-RB。RH44-RB与其亲株RH44相比,菌体生长变慢,糖耗减少,核黄素产量在摇瓶培养下达到6.0 g/l,产率达到0.061(g riboflavin/g glucose),与出发菌RH44相比分别提高了17%和19%。