高寒草甸是甘南草原主要的植被类型之一,其面积占可利用草地面积的11.8%,它不仅是青藏高原最优良的放牧草地,也是天然的绿色生态屏障。然而由于长期超载放牧等不合理利用,导致甘南高寒草甸严重退化,植被覆盖度明显下降,这不仅破坏了当地藏民赖以生息的草地畜牧业的发展,也将对整个青藏高原及其下游地区生态环境产生不利的影响。已有大量报道表明长期施肥处理对高寒草甸地上植物群落有较大影响,参与地下物质循环和能量流动的微生物与土壤肥力和植物健康密切相关,但目前施肥处理对高寒草甸土壤微生物的相关报道较少。本研究以甘南州玛曲县高寒草甸(草场)为对象,采用构建克隆文库和实时荧光定量PCR技术,研究了长期施肥对原核微生物和氨氧化子群落结构多样性和功能的影响,探讨原核微生物和氨氧化子响应长期施肥的变化规律,揭示高寒草甸生态系统中原核微生物及氨氧化子与土壤理化因子之间相互关系,为高寒草甸的管理和退化草地的恢复提供理论依据。取得结果如下：1.长期施肥对原核微生物群落结构多样性的影响长期不同施肥处理对高寒草甸土壤中真细菌、古生菌群落结构组成及多样性有较大影响。16S rRNA基因克隆文库结果显示,不同施肥处理的高寒草甸土壤中真细菌群落由酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria(α,β,δ-))、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、假单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿湾菌门(Chloroflexi)和未分类(Unclassified)等八个类群组成。其中变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)为优势类群。古生菌16S rRNA基因的系统发育分析结果显示所有序列均属于泉古菌门(Crenarchaeota),分属于group1.1b, group1.1a, group1.3类群,其中group1.1b为优势类群。不同放牧强度下施肥对真细菌群落组成分析结果显示,围栏封育处理下随施肥增加Acidobacteria的丰度降低,其中F-0比例最高,占41.32%,F-60最低,占30.06%; Actinomycetes也随施肥浓度的增加而降低；Bacteroidetes随施肥增加,群落组成为F-0<F-30<F-60; β-Proteobacteria与Bacteroidetes具有相同的变化趋势,从F0的5.98%增至F60的8.74%。与前面低施肥浓度的影响截然不同,F-120对细菌群落的影响显著增强。从放牧(G-0)到放牧施肥地(G-30、G-60、G-120),细菌群落结构的变化与围栏封育施肥基本一致。Acidobacteria (26.70%-18.88%)和Actinomycetes (4.54%-0.69%)随施肥增加呈现降低趋势。还有一些类群对施肥的响应表现为丰度增加。Betaproteobacterium丰度为10.79%-16.78%；Detaproteobacterium丰度在5.68%～15.38%; Verrucomicrobia为1.13%-9.94%。另外,我们还发现放牧施肥地Betaproteobacterium和Chloroflexi的丰度高于封育施肥地,Acidobacteria和Bacteroidetes低于封育施肥地。古生菌群落组成分析结果显示：在围栏封育施肥处理样地中,group1.1b为优势类群,group1.1a次之,F-30中group1.1b类群的丰度最低,group1.1a的丰度最高。F-60与F-30相反。放牧施肥处理样地中,优势类群为group1.1b, group1.1a次之,但施肥之间并没有明显的变化趋势。另外,围栏封育施肥后group1.1b丰度明显高于放牧施肥样地,而放牧施肥样地的group1.3明显高于封育施肥样地的丰度。高寒草甸土壤中真细菌的多样性均高于古生菌的多样性。对真细菌而言,Richness指数、Shannon-Weaver指数和Simpson index指数均表现为F-0>F-30>F-60>F-120、G-0G-30>G-60>G-120,结果表明施肥改变了真细菌群落组成,施肥浓度越高细菌群落多样性越低。对古生菌而言,围栏封育样地中Shannon-Weaver指数和Simpson index指数的F-60最低,F-120最高,表明不同施肥处理使古生菌的优势类群发生变化；放牧样地不同施肥处理之间古生菌的Shannon-Weaver指数和Simpson index指数差异不大。2.长期施肥对氨氧化菌群落结构组成、多样性及丰度的影响不同施肥处理的高寒草甸土壤中氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria AOB) amoA基因的荧光定量PCR结果显示,高寒草甸土壤中含有大量的AOA和AOB,并且所有处理中AOA amoA基因的拷贝数均高于AOB。其中AOA的amoA基因的拷贝数介于1.48×109-2.00×109copies/g之间,AOB amoA基因的拷贝数为1.25×107-2.62×108copies/g。随着施肥浓度的增加,AOB的amoA基因数量增加,而AOA的amoA基因数量没有明显地变化。基于amoA基因的克隆文库分析结果显示：施肥处理对AOB的群落结构有较大影响。所有AOB amoA序列均属于β-Proteobacteria的Nitrosospira(亚硝化螺菌属)。其中Nitrosospira cluster4为优势类群,Nitrosospira cluster3a次之,尽管施肥对AOB的优势类群没有明显影响,但施肥尤其高肥导致AOB出现新的clusters类群。cluster9和cluster1仅存在于F60、F90、F120高肥处理中。另外,Nitrosospira cluster2仅在F90和F120中检测到。对于AOA而言,施肥对AOA的群落结构影响不大,基于amoA基因的克隆文库分析结果显示,古生菌amoA基因序列按来源被分为两大分支,即土壤谱系和海洋谱系。CCA分析表明,NH4-N、NO3-N和土壤pH(p=0.044,0.017,0.052)是影响AOB群落结构的主要因子,而有机碳、总氮含量、土壤湿度、有机碳/总氮比值(p=0.494,0.481,0.533,0.218,0.148, respectively)对AOB群落的影响不大。AOA群落与所测的土壤理化因子的相关性不显著。综上所述,长期施肥导致原核微生物群落结构组成和多样性的改变,但真细菌群落变化对施肥的响应更明显；长期施肥影响氨氧化子群落结构和丰度,AOAamoA基因的丰度高于AOB, AOB的丰度和群落组成在施肥处理下变化明显,而AOA基本保持稳定。