诺卡菌是一种机会致病菌，它引起的诺卡菌病可发生于许多人种、职业、年龄，主要引起肺部、皮肤感染以及急性或慢性化脓性或肉芽肿性病变，有时会侵袭脑部，形成脓肿，严重时甚至能够引起病人的死亡。研究人员通过大量的调查研究发现，诺卡菌感染病例正在逐年增加。诺卡菌的常规鉴定方法是分离培养，需要花费大量的时间和人力，通常需要一至三周完成。随着分子生物学的发展，诺卡菌的PCR检测方法也得到了发展。多重PCR和Taqman探针Realtime PCR方法具有特异性好、灵敏度高，自动化程度高、速度快等优点，被广泛应用于微生物学检测。将这两种方法应用到诺卡菌的检测中，为快速分离和临床诊断诺卡氏菌提供一定的参考依据。目的本研究拟建立诺卡菌多重PCR及TaqMan Real-time PCR的检测方法，为临床快速、准确鉴别诊断诺卡菌提供可靠的参考标准。方法1以诺卡菌的16SrRNA、rpoB、SecA1为靶基因，设计这三个基因的特异引物，用诺卡菌标准株DSM43003、临床株CDC51的DNA为模板做单重PCR实验验证引物的特异性。在单重PCR反应的基础上优化多重PCR方法的反应条件和反应体系，同时对44株诺卡菌标准株、44株临床分离株和7株非诺卡氏菌株进行扩增，检验该方法的灵敏度、特异度和实用性。2基于诺卡菌rpoB基因设计TaqMan荧光定量PCR特异的引物与探针，提取鼻疽诺卡菌标准菌株DSM43003的DNA，扩增rpoB基因并纯化PCR产物，连接pMD-18T载体，导入JM109感受态细胞，筛选阳性克隆子并提取质粒，10×倍比稀释所得质粒，制作标准曲线确定所建立方法的检测下限；用29其他致病菌验证引物和探针的特异性；使用痰液模拟标本验证该方法的实际应用性。结果1利用单对引物对其中2株诺卡菌(DSM43003、CDC51)进行扩增，出现的条带均为与目的片段长度一致的单一条带，经测序并经BLAST验证扩增的片段为目的基因。建立的多重PCR方法，44株诺卡菌标准株中有43株(97.7%)、44株临床分离株中有42株(95.5%)3条片段都显示，7珠对照菌株均未显示条带。2建立诺卡菌TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线，确定该方法可以检测到23copy/反应管目的基因，痰液模拟标本检测2.0×102cfu/ml的细菌含量即可被检出；特异性实验中，只有诺卡菌有明显的S型扩增，且荧光信号强，其他菌株未见特异性扩增。结论1.研究建立的多重PCR、Taqman探针Real-time PCR能够快速、准确地鉴别诺卡菌，12小时内能完成对诺卡菌的检测，灵敏度高，特异性强，能够为快速鉴别诊断诺卡菌提供可靠的参考依据。2.多重PCR、Taqman探针Real-time PCR两种方法相对比，多重PCR的成本较低，且实验操作简单易掌握；而Taqman Real-time PCR能够绝对定量地鉴别诺卡菌，灵敏度、特异度更好，敏感性也更强，2.0×102cfu/ml的诺卡菌即可被检出。