研究背景与目的循环肿瘤细胞从实体肿瘤组织中脱落下来并进入患者循环系统,其随着血液循环播散到远处组织形成转移灶,从而加速癌症患者的死亡。目前已经有相当多的文献报道证实检测稀有肿瘤细胞有着重要的意义。比如说在肿瘤早筛方面,又比如说在对肿瘤进行预后评估方面。与目前已知传统肿瘤诊断技术相比,对循环肿瘤细胞的诊断技术具有无创、简单、可以重复取样以检测、便于动态监控等优势。然而由于目前临床上的血液标本中循环肿瘤细胞浓度较低,因此将循环肿瘤细胞作为临床诊断生物标志物所面临的最大挑战之一就是对其高效性的检测。所以说,建立一种高灵敏的、高特异的、简单易操作的肿瘤细胞检测方法是具有巨大的发展潜力的。聚合酶链反应、免疫学和组织细胞化学技术、流式免疫细胞术等这些目前传统用于肿瘤细胞的检测设备技术因为其本身具有检测工艺复杂、费用较高、操作繁琐,而且同时需要价格昂贵的肿瘤检测设备仪器等巨大缺陷从而阻碍了它们在肿瘤临床诊断上的广泛应用。最为重要的一点是,所有的这些方法都不能满足即时检验（point-of-care test,POCT）的要求。以上的这些方面都极大地限制了它们的推广及进一步应用。为了解决这些问题,我们的工作提出了基于双位点催化发夹自组装技术的循环肿瘤细胞检测方法:双位点催化发夹组装是一种步骤简易的、易于操控的核酸等温扩增技术,它通过利用核酸底物之间的程序化组装反应,将化学输入转换成扩增的可被检测的信号。相对于传统的单位点组装技术来说,双位点催化发夹效率更高,它的机制有:一个就是稳定性的提升和能量的增加,在一定程度上可以克服了链置换时的能量障碍。二是因为增加的位点在发生链置换时,即使仅是邻近的发夹茎干发生了部分交换,也可能暴露出足够的3*域,以产生与H2的相互作用,得到更多的H1-H2杂合物。最后我们将这一技术应用于肿瘤细胞的检测。研究方法1.双位点催化发夹自组装体系的建立:1.1设计催化发夹组装反应中的发夹核酸序列,并通过Oligo Analyzer以及NUPACK网站对这两发夹结构引物分别进行自由能计算和稳定性评估。1.2利用核酸电泳技术对双位点催化发夹自组装体系的反应结果进行了分析,验证了双位点催化发夹自组装反应的有效性以及两个发夹序列在触发链不存在的情况下的稳定程度,最后还比较了双位点催化发夹自组装与传统即单位点催化发夹自组装的反应生成的产物。1.3采用分别于发夹序列的5’端和3’端修饰荧光基团和淬灭基团的核酸序列来分析验证这一种双位点催化发夹自组装反应,观察其对靶核酸的荧光响应变化情况,验证了该荧光检测处理系统的应用可行性及其在技术上的优势。1.4采用生物素修饰的寡核苷酸链进行反应,观察双位点催化发夹自组装反应在电化学工作站上的电流响应情况,进一步验证该反应体系的可行性和优势。2.基于双位点催化发夹自组装技术的肿瘤细胞检验平台的性能评估及实践中的能力评定:2.1对检测平台进行电化学表征,选择0.5 mM K3[Fe（CN）6]作为反应液,将不同孵育阶段的电极进行检测,观察电化学工作站收集到的信号变化,验证这一体系是否成功构建。2.2验证延长不同的碱基数及不同的反应温度、反应时间对双位点催化发夹自组装的催化效率影响,最终选择最佳的反应条件。2.3在最佳的延长碱基数、温度、时间等反应条件下,制备不同数量级的肿瘤细胞悬液,应用所提出的肿瘤细胞传感平台,分别对各实验组进行反应终点的电流分析,以验证该肿瘤检测平台的可行性。并通过统计分析得出该肿瘤细胞检测平台的线性范围和检测限,评价其检测灵敏度。2.4在所构建的肿瘤细胞传感平台上,分别对靶肿瘤细胞、不同种乳腺癌细胞、正常体细胞、白细胞、靶肿瘤细胞与正常体细胞混合悬液分别进行检测,分析并比较各组结果,以评价该方法是否具有高度的选择性。2.5随机收集不同病人的全血标本进行混合,以混合全血作为基质,掺入不同数量的靶肿瘤细胞,随后应用我们构建的细胞传感平台进行检测,评估该方法在复杂基质中的应用潜力。2.6收集10例健康者和20例乳腺癌患者的全血标本,经过红细胞裂解后获得细胞沉淀,用PBS缓冲液进行重悬制得细胞悬液后再用建立的平台进行检测,以评估该方法的临床应用价值。结果1.我们不仅通过理论的分析,还采取了核酸电泳分析以及荧光、电化学双平台进行验证,最终得出结论:两发夹结构在没有触发链的存在下,可以相对稳定地共存;只有在加入触发链之后,该双位点催化发夹组装反应可以在短时间内达到信号的平台期,从而得到信号的有效放大,且催化效率明显优于单位点催化发夹组装反应,适用于后续肿瘤细胞传感平台的构建。2.所构建的细胞传感器能选择性识别靶肿瘤细胞并产生相应信号,最佳反应条件下,其在10～1000个细胞/毫升检测范围内具有良好的线性,线性方程为:y=0.831+0.215log10C,通过统计分析,检测限为4个细胞/毫升。除此之外,该细胞传感器能优秀地区分靶肿瘤细胞与非靶细胞（包括靶蛋白表达量不同的乳腺癌细胞、正常细胞和白细胞）。而且,这一方法在对不同浓度的靶肿瘤细胞进行检测时,无论是在缓冲液中,还是在复杂基质中,得到的检测结果相差无几。最后通过对健康者以及乳腺癌患者的全血标本进行检测,最终的结果是该传感器可以实现乳腺癌患者和健康者之间的区分（AUC:0.955,灵敏度达到85%,特异度达到100%）。结论在这个工作中,我们建立了一种基于双位点催化发夹自组装技术的肿瘤细胞传感平台,整个平台无需酶参与,操作简便,并且可以通过改变不同适体即可检测不同来源的循环肿瘤细胞。该平台也在临床标本中得到初步验证。该检测方法的通用性和简便性将会使其能更广泛地应用于临床诊断、即时检验及生物医学研究。