论文部分内容阅读
目的:乳糜泻是一种遗传易感人群摄入麸质蛋白引起的肠道疾病。摄入的麸质蛋白尤其是麦醇溶蛋白,触发免疫反应和氧化应激,造成肠道的炎症和损伤。目前乳糜泻最好的治疗措施是终生严格执行无麸质饮食。然而,因麸质蛋白在食品加工业中的广泛应用,使患者在日常生活中常不可避免地被动摄入麸质。因此,探寻新的冶疗方法用于辅助或替代无麸质饮食疗法,有着重要的意义。黑米是一种营养丰富的粮食作物,富含花青素,具有抗炎、抗氧化应激等作用。探讨摄入富含花青素的黑米提取物是否可作为营养干预措施,缓解麦醇溶蛋白引起的肠道损伤,辅助治疗乳糜泻,是本研究的主要目的。方法:提取黑米中的有效成分花青素,通过Caco-2细胞增殖/毒性实验,筛选出黑米提取物和麦醇溶蛋白模似胃肠消化产物的最佳作用浓度;建立21天Caco-2细胞单层模型,经不同剂量的黑米提取物预处理后,顶侧加入麦醇溶蛋白消化产物孵育24h,检测氧化指标活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量;ELISA法检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-15和Zonulin的释放;采用荧光素钠,测定Caco-2细胞单层通透性;Western blotting检测Occludin、ZO-1、Claudin-1三种紧密连接蛋白的表达,荧光定量PCR检测三种紧密连接蛋白m RNA的表达;采用R5竞争性ELISA定量检测不同时间点基底侧麦醇溶蛋白的含量。选用无麸质饲养的C57BL/6二代雌性小鼠,采用麦醇溶蛋白(400 mg/kg)和小麦淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(30 mg/kg)联合灌胃构建肠道免疫损伤模型。建模过程中给予黑米提取物(100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg),测定血清中特异性抗体Ig G、Ig G1和Ig A的含量,血清中细胞因子IL-4、IL-10、IL-1、IL-1、IL-8、IL-17A、IL-6、IFN-r、TNF-的水平;血清中氧化指标NO、GSH、SOD的含量;肠道中细胞因子IL-10、IL-8、IL-17A、IL-15、IFN-r水平和肠道中Occludin、ZO-1、Claudin-1紧密连接蛋白的表达量及其m RNA的表达量。HE染色检测十二指肠、空肠的组织形态学变化。流式细胞术鉴定脾和肠系膜淋巴结细胞中T细胞分型Th1、Th2、Th17及CD4、CD8。结果:黑米提取物中花青素含量为34.8%。经Caco-2细胞增殖/毒性实验,筛选出黑米提取物最佳作用浓度为50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L,麦醇溶蛋白消化产物最佳作用浓度为1.5 mg/m L。通过电阻值、碱性磷酸酶的活性、荧光素钠转运率验证构建了完整的Caco-2细胞单层。麦醇溶蛋白消化产物可显著提高细胞内ROS的含量,降低SOD和GSH的含量,促进细胞内IL-6、IL-8和IL-15的分泌,促进Zonulin的释放(P<0.05),降低Occludin、Claudin-1、ZO-1三种紧密连接蛋白的表达及其m RNA基因的表达(P<0.05),造成了Caco-2细胞屏障损伤,使细胞单层通透性增加,麦醇溶蛋白跨膜转运量增加。经50μg/m L、100μg/m L黑米提取物预处理,可降低细胞内ROS的含量,提高SOD和GSH的含量,抑制细胞因子IL-6、IL-8、IL-15和Zonulin的分泌(P<0.05);上调三种紧密连接蛋白及m RNA的表达,降低麦醇溶蛋白消化产物诱导增加的通透性(P<0.05),有效缓解麦醇溶蛋白消化产物诱导的Caco-2细胞屏障损伤,减少麦醇溶蛋白的跨膜转运,降低其在细胞内的浓度(P<0.05)。小鼠实验中,麦醇溶蛋白可显著增加血清中特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig A水平(P<0.05);促进小鼠血清和肠道IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17A、IL-6、IL-15、IFN-r、TNF-α的分泌,抑制了IL-4的分泌(P<0.01);增加了血清中NO的含量,降低了SOD和GSH的含量(P<0.05);打乱了T细胞亚群的分布,增加了脾脏和肠系膜淋巴结中Th1型细胞的数量,降低了肠道紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1三种紧密连接蛋白的表达及其m RNA的表达(P<0.05),十二指肠和空肠出现明显的炎细胞浸润和绒毛萎缩,成功构建了麦醇溶蛋白所致肠道免疫损伤的模型。100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg黑米提取物均可抑制由麦醇溶蛋白引起的细胞因子的分泌增加,同时升高了IL-4的水平,降低中血清NO的含量,升高SOD和GSH和的含量(P<0.05);相对减少Th1型细胞的数量,调节Th1细胞亚群朝向Th2分化,增加三种紧密连接蛋白的表达及m RNA基因的表达(P<0.05),明显改善麦醇溶蛋白所致的十二指肠、空肠的组织病理学改变。100 mg/kg、200 mg/kg黑米提取物对肠道损伤的缓解效果更优。结论:黑米提取物通过抗炎、抗氧化、免疫调节,改善肠道屏障功能,缓解麦醇溶蛋白对肠道的损伤,有助于辅助治疗乳糜泻。