目的:阿霉素是一种有效治疗乳腺癌的化疗药物,但阿霉素在临床应用中会产生严重的心脏毒性。在前期的研究中发现丹参素衍生物BAA具有增强阿霉素抗乳腺癌并减轻心肌细胞毒性的作用,并发现ERp57是BAA的作用靶点之一。本文旨在探讨ERp57在体外对阿霉素抗乳腺癌和对心肌细胞毒性的干预作用及其相关作用机制。方法:1.ERp57体外增强阿霉素抗乳腺癌及减轻心肌细胞毒性干预作用的研究首先验证ERp57过表达的MDA-MB-231细胞和H9c2细胞模型,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)确认过表达。然后加入不同浓度的阿霉素(1μM、2μM、4μM、8μM)处理细胞24 h后,采用乳酸脱氢酶试剂盒和MTT法检测细胞毒性和细胞存活率;在MDA-MB-231细胞和H9c2细胞(EV组和ERp57~H组)中加入2μM阿霉素处理细胞24 h后,固定细胞,进行DAPI染色;野生型MDA-MB-231细胞和H9c2细胞采用瞬时转染siRNA方法使ERp57基因沉默,经Western Blot确认转染成功后,MTT法检测细胞存活率。2.ERp57体外增强阿霉素抗乳腺癌及减轻心肌细胞毒性作用的机制研究用阿霉素(2μM)处理MDA-MB-231细胞和H9c2细胞(EV组和ERp57~H组)24 h后提取蛋白,进行蛋白质组学分析,主要采用非依赖采集定量技术(DIA),然后将差异蛋白进行通路富集分析,确定可能参与的信号通路;对蛋白质组学分析结果中得到的差异蛋白和富集的相关信号通路蛋白进行Western Blot验证。结果:1.ERp57对阿霉素体外抗乳腺癌及心肌细胞毒性具有干预作用在MDA-MB-231细胞中,加入阿霉素处理细胞24 h后,结果显示随着阿霉素浓度的增加,细胞存活率不断降低且呈浓度依赖性关系,而ERp57基因的过表达可以增加阿霉素诱导乳腺癌细胞凋亡的细胞存活率且乳酸脱氢酶的释放量减少;在DAPI的染色实验中,加入2μM阿霉素处理24 h后,结果显示ERp57过表达减少了MDA-MB-231细胞的凋亡;瞬时转染siRNA干扰的实验表明,ERp57基因沉默后可以进一步促进阿霉素诱导的MDA-MB-231细胞凋亡。与之相反的,在心肌细胞H9c2中,不同浓度的阿霉素处理细胞24 h后,MTT和LDH的结果表明ERp57基因过表达后进一步降低了心肌细胞的存活率且心肌细胞毒性增强,DAPI染色的实验结果证实ERp57基因过表达后能够促进H9c2的细胞凋亡;在ERp57-siRNA干扰实验中,ERp57基因沉默后H9c2细胞中阿霉素诱导的细胞凋亡明显减少。2.ERp57体外增强阿霉素抗乳腺癌及减轻心肌细胞毒性作用的机制研究蛋白质组学通路富集和差异蛋白的分析结果预测,ERp57体外增强阿霉素抗乳腺癌及减轻心肌细胞毒性作用的机制可能与UPR反应相关。经Western Blot验证后,结果显示在乳腺癌细胞MDA-MB-231中,ERp57过表达后加入阿霉素,Sec61γ,ERp57,BAP31,GRP78,p-IRE1α,TRAF2,CHOP,p-eIf2α,Cleaved caspase 3和Bax/Bcl-2的蛋白表达量减少,而p-PERK和ATF4的蛋白表达量没有显著变化。结果表明,在乳腺癌细胞MDA-MB-231中,ERp57过表达后抑制了未折叠蛋白反应(UPR)相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。与之相反的,在大鼠心肌细胞H9c2中,加入阿霉素处理24 h后,同样方法检测UPR反应和凋亡相关蛋白表达的变化,结果显示ERp57过表达后进一步增加了Sec61γ,ERp57,BAP31,GRP78,p-IRE1α,TRAF2,p-PERK,p-eIf2α,ATF4,CHOP以及凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3,Bax/Bcl-2的表达。结果显示,在心肌细胞H9c2中,ERp57过表达后UPR反应相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达量明显上调。结论:1.在体外,ERp57基因沉默和基因过表达后,对阿霉素诱导的乳腺癌凋亡和心肌细胞毒性具有不同的调节作用,ERp57过表达在MDA-MB-231细胞中发挥保护作用,在H9c2细胞中发挥促凋亡作用,而ERp57基因沉默后在MDA-MB-231细胞中具有促凋亡作用,在H9c2细胞中具有保护性效果。因此,ERp57功能的抑制,在体外具有增强阿霉素抗乳腺癌及减轻心肌细胞毒性的作用。对于乳腺癌的蒽环类药物治疗,ERp57是一个增效减毒的潜在药物靶点。2.在MDA-MB-231细胞和H9c2细胞中ERp57过表达后加入阿霉素,UPR反应和细胞凋亡相关蛋白的表达具有不同的变化。在MDA-MB-231细胞中,可能通过抑制UPR反应从而有助于细胞的存活,在H9c2细胞中,可能通过增强UPR反应进一步促进细胞凋亡。因此,ERp57体外增强阿霉素抗乳腺癌并减轻心肌细胞毒性的作用机制可能与UPR反应和凋亡信号途径有关。