论文部分内容阅读
目的:Intermedin（IMD）是一种可以表达在肾脏内皮细胞中的生物活性肽,能通过抑制氧化应激减轻肾间质纤维化,从而延缓慢性肾脏病的发生。研究显示,IMD能激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制26S蛋白酶体减少I型三磷酸鸟苷环化水解酶（GTPCH-I）降解,而GTPCH-I高表达可以减少内皮一氧化氮合酶（eNOS）解偶联,减少活性氧族（ROS）产生。因此,我们推测IMD可能通过抑制eNOS解偶联保护内皮细胞。本实验探究AMPK/26S蛋白酶体-GTPCH-I信号通路是否参与了IMD抑制eNOS解偶联的过程,从而阐明IMD通过抑制eNOS解偶联减少ROS产生保护内皮细胞的分子机制。方法:1.建立细胞缺氧复氧模型。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在含有92%N2+5%CO2+3%O2的三气培养箱缺氧培养18小时后,放入正常培养箱复氧培养6小时。2.将状态良好的HUVECs随机分为正常对照组、缺氧复氧模型组、IMD干预组、IMD+compound C（AMPK抑制剂）干预组。干预组细胞均在加入药物的培养基中预处理1小时后进行缺氧复氧培养。3.通过Western blot法测定eNOS二聚体/单体表达,观察IMD对eNOS解偶联的影响。4.通过Western blot法测定GTPCH-1的表达,观察IMD对GTPCH-I表达的影响。5.通过Elisa法测定26S蛋白酶体活性,观察IMD对26S蛋白酶体活性的影响。6.通过Western blot法测定p-AMPK和总AMPK的表达,观察IMD对AMPK活性的影响。结果:1.与对照组相比,缺氧复氧模型组中eNOS二聚体/单体表达明显减少,说明eNOS发生解偶联;IMD干预后,该比值明显增大,说明IMD能抑制eNOS解偶联;IMD干预的同时加入compound C,该比值明显下降,说明IMD通过compound C抑制eNOS解偶联。2.与对照组相比,缺氧复氧模型组中GTPCH-I表达减少,说明缺氧导致GTPCH-I降解;IMD干预后,GTPCH-I表达明显增多,说明IMD能抑制其降解;IMD干预的同时加入compound C,GTPCH-I表达明显减少,说明IMD通过compound C抑制GTPCH-I降解。3.与对照组相比,缺氧复氧模型组中26S蛋白酶体活性增高,说明缺氧可诱导26S蛋白酶体活性增高;IMD干预后,其活性明显降低,说明IMD能抑制其活性;IMD干预的同时加入compound C,其活性明显增高,说明IMD通过compound C抑制26S蛋白酶体活性。4.与对照组相比,缺氧复氧模型组中p-AMPK/AMPK表达减少,说明缺氧抑制AMPK磷酸化;IMD干预后,该比值明显增大,说明IMD能激活AMPK;IMD干预的同时加入compound C后,该比值明显减小,说明IMD通过激活AMPK抑制26S蛋白酶体减少GTPCH-I降解,从而抑制eNOS解偶联。结论:IMD通过激活AMPK/26S蛋白酶体-GTPCH-I信号通路抑制eNOS解偶联减轻氧化应激,保护血管内皮细胞。