【摘 要】
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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种高度传染性疾病,临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水,新生仔猪感染后发病率和死亡率极高。2010年以来,G2型PEDV毒株在我国引起了PED的大规模爆发,免疫接种是防控PED的重要手段,但当前缺乏用于PED免疫监测的有
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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种高度传染性疾病,临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水,新生仔猪感染后发病率和死亡率极高。2010年以来,G2型PEDV毒株在我国引起了PED的大规模爆发,免疫接种是防控PED的重要手段,但当前缺乏用于PED免疫监测的有效方法,无法对猪群感染或免疫后体内的抗体水平进行评估,因此本研究旨在建立一种能用于PED免疫评估的间接ELISA抗体检测方法。主要研究内容如下:1.为建立能表达PEDV S1蛋白的ST稳转细胞池,本研究以EGFP为报告基因,对ST细胞最佳电穿孔转染条件和G418加压筛选浓度进行摸索,最终确定在4 mm电转杯中ST细胞最佳电穿孔转染条件为质粒用量20μg,电压380V,脉冲时间40μs,电击1次;ST细胞G418最佳加压筛选浓度为200μg/m L。2.将PEDV S1基因克隆至p IRES1-neo哺乳动物细胞表达载体中,构建p IRES-S1重组表达质粒。随后通过电穿孔转染法将p IRES-S1转染至ST细胞中,经过G418加压筛选、Western blot检测、悬浮驯化后得到能表达PEDV S1蛋白的ST稳转细胞池。本研究中获得的PEDV S1蛋白分子量大小约为120 k Da,表明在ST细胞中表达的PEDV S1蛋白进行了糖基化修饰。Western blot结果显示PEDV S1蛋白与PEDV阳性血清反应信号强,表明其具有良好的反应原性。3.以PEDV S1蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法S1-ELISA,并对抗原包被浓度、血清和酶标二抗稀释倍数、底物作用时间各条件进行了优化。S1-ELISA方法与CSFV、PCV2、PRV-g E、PRV-g B、PRRSV、FMDV阳性血清无交叉反应,可检测到6400倍稀释的PEDV阳性血清,批内和批间重复性变异系数均小于5%,抗原板稳定性好,在室温（25℃）放置6 d抗原板间总体平均变异系数为4.25%。以血清中和试验为标准,本研究建立的S1-ELISA方法敏感性为96.3%,特异性为97.7%,与血清中和试验具有很高的一致性（Kappa值=0.882,P＜0.05）。与IDEXX PEDV Ig A抗体检测试剂盒比较,结果显示S1-ELISA方法对血清中和效价较低的血清有更高的抗体检出率,能更准确的反应猪血清中抗PEDV中和抗体水平。4.应用本研究建立的S1-ELISA方法对PEDV临床血清进行检测,结果表明S1-ELISA方法可用于检测感染或免疫猪体内特异性抗PEDV Ig G抗体水平,且抗体水平与临床保护状态相关,对评估猪群PED免疫保护状态具有重要意义。
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