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研究一逐瘀壮骨汤对大鼠激素性股骨头坏死的干预作用目的:实验通过建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型,并对大鼠进行逐瘀壮骨汤药物灌服后,观察大鼠血液中骨钙素、甘油三酯含量及股骨头组织HE染色情况,以此探讨逐瘀壮骨汤对大鼠激素性股骨头坏死的干预作用。方法:通过在SD大鼠臀肌注射皮质类固醇激素的方法,建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型,将90只SD大鼠随机平分为空白组(n=30)、模型组(n=30)、治疗组(n=30),每组各30只,模型组及治疗组醋酸泼尼松龙注射液20mg/kg/只,同时臀肌注射青霉素8万单位/只,庆大霉素4万单位/只,每周3次,连续3周。3周后通过HE染色观察大鼠股骨头组织,确定模型建立成功后,参照大鼠用药及体表面积计算公式后得出,治疗组每只SD大鼠每天灌服逐瘀壮骨汤2.01ml,其余各组灌服等剂量生理盐水。灌服8周后,采集大鼠颈静脉血液检测血清OCN、TG含量,取出大鼠股骨头组织进行HE染色镜下观察,观察股骨头组织骨结构及骨细胞数量情况,以分析逐瘀壮骨汤对大鼠激素性股骨头坏死的干预作用。结果:与模型组含量相比,其余各组大鼠血清OCN含量有显著性提升(P<0.01),而血清TG含量有显著性下降(P<0.01);HE染色结果显示,模型组大鼠股骨头软骨下区骨小梁形态出现破坏,骨小梁体积分数、骨小梁厚度及数量均较空白组低。空白组股骨头软骨下骨小梁紧凑精密,成骨细胞核小,着色深,嗜碱性,胞体呈梭形,单层排列,胞质不清,埋于骨质中,骨陷窝空虚情况较少。模型组软骨下骨骨小梁疏松,排列不整齐,个别处有断裂现象,成骨细胞较少,与空白组比较,模型组空骨陷窝率有显著性增多(P<0.01)。治疗组骨小梁破坏情况较模型组有显著改善,骨小梁体积分数、骨小梁厚度及数量也较模型组有较大提升,骨小梁排列较模型组有较大改观,骨细胞增多,结构可,与模型组对比,空骨陷窝率有显著性减少(P<0.01)。结论:逐瘀壮骨汤可显著提高激素性股骨头坏死大鼠血清OCN的含量,降低血清TG含量,促进大鼠激素性股骨头坏死骨的骨小梁修复,改善股骨头软骨下结构,提高股骨头区域成骨细胞的数量,减少骨陷窝空虚数量,对大鼠激素性股骨头坏死有较好的治疗效果。研究二逐瘀壮骨汤对激素诱导大鼠BMSCs增殖及分化的影响目的:研究逐瘀壮骨汤对激素诱导BMSCs增殖活性及分化过程中RhoA/ROCK通路上相关因子的表达,并探讨逐瘀壮骨汤干预大鼠激素性股骨头坏死的作用机制。方法:采用离体实验方法,取SD清洁大鼠,从大鼠股骨、胫骨分离大鼠BMSCs进行体外培养并传代,同时制备大鼠逐瘀壮骨汤含药血清,体外BMSCs用地塞米松磷酸钠注射液进行干预,观察不同浓度含药血清对激素干预BMSCs的影响,CCK-8方法检测细胞增殖活力,克隆形成实验计数BMSCs克隆数目,运用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红、油红“0”染色法,运用氧化酶、Elisa法检测细胞上清液TG、OCN表达含量,以分析BMSCs的成骨、成脂情况。PCR、Western-blot方法检测RhoA/ROCK通路及下游因子RUNX-2、OPN表达情况,并在细胞分子生物学水平分析逐瘀壮骨汤治疗大鼠激素性股骨头坏死的作用靶点及机制。结果:BMSCs体外培养后用倒置显微镜观察细胞呈梭形及螺旋状排列。将细胞分为空白组、模型组、含药血清低、中、高浓度组,空白组培养基外加入正常大鼠血清,模型组在空白组细胞培养基外加入地塞米松磷酸钠并将浓度调至10-6mol/l用以激素干预,含药血清组在模型组培养基外再加入不同浓度的逐瘀壮骨汤含药血清。CCK-8检测各组细胞总体及第24h、72h、120h、168h的0D值,结果显示:与模型组相比,其余各组细胞总体及第72h、120h、168h 0D值有显著增高(P<0.01);与低浓度含药血清组比较,中、高浓度含药血清组细胞总体及第72h、120h、168h时0D值有显著增高(P<0.01);与中浓度含药血清组比较,高浓度含药血清组总体及第72h、120h、168h时0D值有显著增高(P<0.01)。细胞克隆形成实验计数结果显示:与模型组相比,其余各组细胞的克隆数目均显著性增加(<0.01),含药血清各组之间比较,与低浓度含药血清组相比,中、高浓度含药血清组细胞克隆数目有显著性增高(P<0.05);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组细胞克隆数目无显著性差异(P>0.05)。油红“0”染色观察可见,模型组可见大片脂细胞红染,其余各组脂细胞红染程度均明显弱于模型组。脂肪细胞阳性率统计结果:与模型组相比,其余各组脂肪细胞阳性率有显著性降低(P<0.01);与低浓度含药血清组相比,中、高浓度含药血清组脂肪细胞阳性率有显著性降低(P<0.01);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组脂肪细胞阳性率有显著性降低(P<0.01)。细胞上清液TG含量测定结果:与模型组相比,其余各组细胞TG含量有显著性降低(P<0.01);与低浓度含药血清组相比,中、高浓度含药血清组细胞TG含量有显著性降低(P<0.01);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组细胞TG含量有显著性降低(P<0.05)。各组细胞成骨诱导后,ALP染色结果显示:模型组几乎未见阳性成骨细胞蓝染,其余各组ALP染色程度均高于模型组,与模型组比较,空白组、低、中、高浓度含药血清组ALP染色平均光密度均显著性增高(P<0.01);与低浓度含药血清组比较,中浓度含药血清组ALP染色平均光密度未见明显差异(P>0.05),高浓度含药血清组ALP染色平均光密度有显著性增高(P<0.01)。与含药血清中浓度组比较,高浓度含药血清组ALP染色平均光密度有显著性增高(P<0.01)。茜素红钙结节染色镜下可见:模型组几乎未见阳性钙结节出现,其余各组茜素红染色均有钙结节形成。钙结节染色平均光密度分析结果:与模型组相比,其余各组细胞钙结节染色平均光密度有显著性增高(P<0.01);与低浓度含药血清组相比,中浓度含药血清组细胞平均光密度无显著性差异(P>0.05),高浓度含药血清组细胞平均光密度有显著性增高(P<0.01);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组细胞平均光密度有显著性增高(P<0.01)。细胞上清液OCN含量测定结果:与模型组相比,其余各组细胞OCN含量有显著性增高(P<0.01);与低浓度含药血清组相比,中、高浓度含药血清组细胞OCN含量有显著性增高(P<0.01);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组细胞OCN含量有显著性增高(P<0.01)。RT-PCR结果显示:与模型组相比,其余各组RhoA、ROCK-1、RUNX-2、OPN因子mRNA表达含量有显著性增高(P<0.05);与低浓度含药血清组相比,中、高浓度含药血清组RhoA、ROCK-1、RUNX-2因子mRNA表达量有显著性增高(P<0.01),高浓度含药血清组OPN因子mRNA表达量有显著性增高(P<0.01),中浓度含药血清组OPN因子mRNA表达含量无显著性差异(P>0.05);与中浓度含药血清组相比,高浓度含药血清组RhoA、ROCK-1、RUNX-2、OPN因子mRNA表达含量有显著性增高(P<0.05)。Western-Blot结果显示:与模型组相比,其余各组RhoA、ROCK-1、RUNX-2、OPN因子蛋白表达含量有显著性增高(P<0.05);与低浓度含药血清组相比,中浓度含药血清组RhoA、ROCK-1因子蛋白表达含量无显著性差异(P>0.05),高浓度含药血清组RhoA、ROCK-1因子蛋白表达含量有显著性增高(P<0.05),中、高浓度含药血清组RUNX-2、OPN因子蛋白表达含量有显著性增高(P<0.01);与含药血清中浓度组相比,高浓度含药血清组RhoA、ROCK-1、RUNX-2、OPN因子蛋白表达含量均有显著性增高(P<0.05)。结论:逐瘀壮骨汤可显著提升激素诱导BMSCs的增殖活性,其调控激素诱导BMSCs分化的机制可能是通过促进RhoA/ROCK信号通路的开放,并上调下游因子RUNX-2、OPN的表达,进而促进BMSCs的成骨分化,抑制成脂分化。