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自2015年5月以来,由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)新基因型引起的鸡肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)在我国山东、江苏、安徽、河南、河北、辽宁、吉林、浙江、湖北和山西等地区大面积暴发,给我国养禽业带来很大的经济损失[86]。HHS主要影响3～5周龄肉鸡,该病以导致20%～80%的死亡率,心包膜内出现淡黄色积液、肝脏肿大褪色、有坏死点和肾炎为主要特征。研制针对FAdV-4中国流行株的新型高效疫苗和相关的检测试剂及检测方法对于有效防控HHS在中国的流行具有重要意义。本论文利用反向遗传技术首次构建出表达FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的rLaSota-Fiber2。建立检测抗Fiber2抗体的间接ELISA方法,并对rLaSota-Fiber2的免疫原性和免疫效力进行了评价。论文包括以下几方面的内容:1、表达高致病性FAdV-4 Fiber2基因的重组NDV LaSota株的构建与鉴定鉴于养禽实践中FAdV-4与NDV经常混合感染,为研制用于防控NDV和FAdV-4感染的安全、廉价和高效疫苗奠定基础。本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将FAdV-4中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID50)最高可达108.5,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h,1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了 LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本研究构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。2、FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的原核表达与间接ELISA抗体检测方法的建立为建立FAdV-4特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的编码基因克隆于pET-32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的Fiber2蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化,建立了一种检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法[87]。结果显示,该方法可以特异地检测抗FAdV-4抗体,与新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、H5和H9亚型禽流感病毒等常见禽病毒的抗血清均无交叉反应,表明所建立ELISA具有较好的特异性[87]。FAdV-4阳性血清经1:3200稀释后检测结果仍为阳性,表明所建立ELISA方法具有较高的敏感性。所建立ELISA的批内和批间重复试验的变异系数分别为1.5%～5.2%和1.1%～5.6%,表明其重复性良好[87]。应用建立的ELISA方法对河南省及周边部分地区养禽场内FAdV-4的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区养禽场均存在不同程度的禽腺病毒4型抗体阳性,平均阳性率为59.53%。所建立的ELISA方法可以用于FAdV-4抗体的检测,为HHS疫苗免疫原性的检测和FAdV-4流行病学调查提供了方法[87]。3、表达高致病性FAdV-4 Fiber 2基因的重组NDV LaSota株的免疫原性和免疫效力评价为了评价重组病毒rLaSota-Fiber2的免疫原性与免疫效力,对2周龄的SPF鸡肌肉注射rLaSota-Fiber2弱毒活疫苗和rLaSota-Fiber2油乳剂灭活疫苗,利用所建立的FAdV-4间接ELISA抗体检测方法检测疫苗免疫后的抗FAdV-4抗体水平,利用血凝抑制试验检测抗NDV抗体。结果显示,两种疫苗均可以诱导鸡产生高水平的抗FAdV-4特异性抗体。攻毒结果显示,两种疫苗的单剂量免疫均可对NDV提供完全保护,而rLaSota-Fiber2活疫苗对FAdV-4强毒攻击的保护好于rLaSota-Fiber2油乳剂灭活疫苗。研究结果显示,rLaSota-Fiber2可作为控制HHS和ND的二联疫苗候选株。