第一章COPD肺血管内皮细胞凋亡和COX表达与功能的改变及其发生机制初探目的:观察COPD患者肺组织中血管内皮细胞凋亡、COX功能和COXⅡ表达变化,探讨COPD可能的发病机制。方法:2007年9月至2008年5月在中南大学湘雅二医院胸外科行肺切除术的周围型肺癌患者病例20例,根据COPD诊断标准和WHO吸烟调查方法标准将其分成3组:A组（非吸烟非COPD组）,7例;B组（吸烟非COPD组）,7例;C组（吸烟并COPD组）,6例。TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡指数,分光光度法检测COX活性,普通RT-PCR和荧光RT-PCR（RQ-PCR）检测COXⅡmRNA表达,以及免疫组织化学和WB法检测COXⅡ蛋白的分布和表达。使用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,正态分布的各组计量资料以（?）±s表示,多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,变量间采用单因素相关分析（Pearson）,P＜0.05差异有统计学意义。结果:C组肺血管内皮细胞凋亡指数[（13.8±1.9）%]较B组[（9.6±0.8）%]和A组[（5.9±1.0）%]均增高,任意两组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。A组COX活性、COXⅡmRNA的ΔΔCt值和COXⅡ蛋白OD值分别为（7.6±0.4）×10^-1U/mg、（0.86±0.20）和（0.99±0.14）;B组分别为（6.0±0.6）×10^-1U/mg、（0.8±0.15）和（0.81±0.09）;而C组分别为（4.4±0.7）×10^-1U/mg、（0.76±0.17）和（0.60±0.07）,各变量在A、B、C三组中依次下降,任意两组间差异有显著性（均P＜0.05）。经相关性分析,细胞凋亡指数与FEV₁/Pre呈负相关（r=-0.846,P＜0.01）,与吸烟指数正相关（r=0.794,P＜0.01）。COX活性与FEV₁/Pre呈正相关（r=0.842,P＜0.01）,与吸烟指数负相关（r=-0.783,P＜0.01）。结论:（1）COPD患者肺血管内皮细胞凋亡。（2）COPD患者肺组织COXⅡ表达抑制并且COX活性下降。（3）吸烟可能与肺血管内皮细胞凋亡、COXⅡ表达抑制及COX活性下降有关。（4）COX可能介导COPD肺血管内皮细胞凋亡。第二章COPD患者COXⅡ的甲基化状态及其与COPD的关系目的:探讨COPD患者COXⅡ甲基化状态及其与COPD的关系。方法:2007年9月至2008年5月在中南大学湘雅二医院胸外科行肺切除术的周围型肺癌患者病例20例,根据最新COPD诊断标准和WHO吸烟调查方法标准将其分成3组:A组（非吸烟非COPD组）,7例;B组（吸烟非COPD组）,7例;C组（吸烟并COPD组）,6例,分别收集患者肺组织。同期在该院呼吸内科住院的吸烟并COPD患者10例和健康体检者20例,分为3组:D组（非吸烟非COPD组）,10例;E组（吸烟非COPD组）,10例（入选时均处于稳定期）;F组（吸烟并COPD组）,10例,分别收集其外周血5ml。提取肺组织和血标本中基因组DNA,亚硫酸盐修饰后MSP检测COXⅡ甲基化。使用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料以（?）±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析（One—Way ANOVA）。计数资料以率表示,组间COXⅡ甲基化阳性率差异用Fisher确切概率法进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:A、B、C三组肺组织标本中COXⅡ甲基化阳性率分别为71.4%（5/7）、71.4%（5/7）和66.7%（4/6）,三组间无明显统计学差异（均P＞0.50）。D、E、F三组血标本中COXⅡ甲基化阳性率分别为0%（0/10）、50%（5/10）和60%（6/10）。D组与E组或F组比较,COXⅡ甲基化阳性率差异均有统计学差异（均P＜0.05）,而E组与F组比较,统计学差异不显著（P＞0.50）。结论:COPD患者存在COXⅡ甲基化,该异常甲基化可能与吸烟有关。第三章CSE诱导HUVEC凋亡中COXⅡ甲基化状态改变及5-杂氮-2’-脱氧胞苷干预的影响目的:研究CSE诱导HUVEC凋亡的机制,探讨COX在其中的作用,并了解COXⅡ甲基化是否参与其中机制。方法:第一部分,体外培养HUVEC,给予不同浓度（0%-10%）和不同时间（0h-24h）的CSE处理,TUNEL法检测细胞凋亡,分光光度计检测其COX和caspase-3的活性。第二部分,将HUVEC分为四个处理组:空白组,AZA组,CSE（2.5%）组,AZA+CSE组,分别给予不同的干预,检测各组细胞的凋亡指数和COX活性。荧光RQ-PCR和Western Blot分别检测COXⅡmRNA和COXⅡ蛋白表达。提取各组细胞DNA,MSP法检测各组COXⅡ甲基化状态。用SPSS13.0进行数据分析,计量数据用（?）±s表示,多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）。变量间采用单因素相关分析（Pearson）法。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:第一部分:CSE诱导的HUVEC凋亡呈浓度-和时间-依赖。1%CSE组即出现HUVEC凋亡增加[（26.0±2.1）%],2.5%CSE时凋亡指数达到（42.6±2.6）%。此后CSE浓度继续增加,虽然凋亡仍在增加,但细胞坏死也逐渐明显。10%CSE干预24h后HUVEC凋亡达到最高峰（49.5±0.7）%。2.5%CSE干预HUVEC,随着干预时间的延长凋亡逐渐增多。与凋亡相反,随着CSE干预浓度和时间的增加,COX活性下降愈明显,同样呈浓度-和时间-依赖。10%CSE干预24h后,COX活性下降约25.6%。在较低CSE干预浓度（0.5%-2.5%）时caspase-3活性随着CSE浓度增加而增加,2.5%CSE组达到最大值（255.0±24.2%）。而在较高CSE浓度（5%-10%）干预时,caspase-3活性出现回降,10%CSE组降至（68.6±3.7）%,低于空白对照组。经相关分析,HUVEC凋亡与COX活性呈负相关（r=-0.884,P＜0.01）,而与caspase-3活性无关（r=-0.236,P＞0.05）。第二部分:与对照组相比,CSE组[（44.0±3.6）%]和AZA+CSE组[（21.7±2.3）%]HUVEC凋亡增加;而COX活性[分别为（5.94±0.36）×10^-1U/mg和（6.83±0.26）×10^-1U/mg]、COXⅡmRNA表达[分别为（0.82±0.06）和（1.18±0.08）]和COXⅡ蛋白表达[分别为（0.73±0.05）和（1.10±0.12）]均下降,三组间各指标差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而AZA组与对照组比较无显著差异。MSP检验发现CSE组和AZA+CSE组出现COXⅡ甲基化阳性表达,而对照组和AZA组甲基化阴性。结论:（1）CSE诱导HUVEC凋亡呈浓度-和时间-依赖性,该凋亡为非caspase-3-依赖,并由COX介导。（2）CSE可能通过诱导COXⅡ发生甲基化而抑制COXⅡ转录。（3）AZA能一定程度逆转CSE诱导的COXⅡ甲基化,对COX和HUVEC有保护作用。