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甲硫氨酸为人体必需氨基酸，在食品、医药以及饲料添加剂方面有广泛应用。工业上主要通过化学法合成DL-型混旋甲硫氨酸，存在环境污染、分离纯化困难等问题，因此微生物发酵法生产L-型甲硫氨酸越来越引起重视。本研究以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，利用代谢工程的方法，经过敲除两个关键基因和表达四个关键基因，最终使甲硫氨酸得到显著积累。研究结果如下：（1）旁路途经的敲除。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，通过敲除编码高丝氨酸激酶的thrB基因，获得菌株WTQ101。WTQ101为L-苏氨酸营养缺陷型，其中L-甲硫氨酸前体L-天冬氨酸和L-高丝氨酸得到积累，但同时L-赖氨酸也得到积累。（2）干路途径的强化。在菌株WTQ101中通过表达编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶的基因homm和lysCm,以及敲除阻遏蛋白McbR，分别获得重组菌WTQ101/pJYW-4-homm-lysCm和WTQ102/pJYW-4-homm-lysCm。基因homm和lysCm的过量表达使更多的L-天冬氨酸转化为L-高丝氨酸，进一步提高了L-甲硫氨酸前体L-高丝氨酸的积累。阻遏蛋白McbR的敲除，解除了L-甲硫氨酸下游合成基因受到的转录阻遏作用，促进了L-高丝氨酸合成L-甲硫氨酸，同时减少了杂酸L-赖氨酸的积累。为进一步考察McbR的作用原理，对甲硫氨酸合成途经相关基因及赖氨酸合成途径关键基因进行了RT-PCR分析，发现经过McbR的敲除，基因metX，metY，metB，metC，metH，metE转录水平均得到上调，而L-赖氨酸合成关键基因dapA则明显下调。（3）转运蛋白的表达。在重组菌WTQ102/pJYW-4-homm-lysCm基础上进一步强化表达了转运蛋白编码基因brnFE，构建重组菌WTQ102/pJYW-4-homm-lysCm-brnFE。经过72h摇瓶发酵，L-甲硫氨酸产量达到12.2mM，但杂酸L-高丝氨酸产量依然很高，成为主要杂酸。为进一步验证转运蛋白BrnFE的作用，基因brnFE表达前后，胞内外L-甲硫氨酸产量被进一步分析，结果表明转运蛋白BrnFE可有效促进L-甲硫氨酸的转运。（4）发酵条件优化及3L发酵罐发酵。在摇瓶水平上优化了甲硫氨酸发酵培养条件，包括有机硫源L-半胱氨酸和L-异亮氨酸的添加浓度，以及发酵pH条件的优化，最终选定L-异亮氨酸添加浓度2mM及pH值6.5作为最终发酵条件。在优化的发酵条件下，对重组菌株WTQ102/pJYW-4-homm-lysCm-brnFE在3L发酵罐上进行发酵，经过72h发酵，L-甲硫氨酸产量达到42mM（6.258g/L），与出发菌株ATCC13032相比，L-甲硫氨酸产量得到明显提高。