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背景:乳腺癌已成为世界范围内女性诊断率和死亡率最高的恶性肿瘤,而三阴性乳腺癌（TNBC）是一种以雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子（Her-2）的缺失为特征的乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌具有易转移,易复发,发病年龄低等特点,目前没有明确的治疗靶点和靶向药。课题组前期以EGFR和Rac1蛋白为靶点,利用分子对接计算机辅助药物设计技术,设计并合成了新型大黄素喹唑啉杂合物7F（文中简称7F）。目的:本文以三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和低转移MCF-7乳腺癌细胞及正常的乳腺上皮细胞MCF-10A为研究对象,研究7F对各种细胞作用后的形态学变化,对细胞的运动、侵袭、周期、凋亡等功能的影响,验证对EGFR和Rac1等靶点的调控,揭示7F对于乳腺癌细胞的死亡机制及相关蛋白的影响。研究7F抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231浸润转移所涉及的机制,获得抑制三阴性乳腺癌的新型化合物。方法:1.采用分子对接软件MOE.2008评价吉非替尼、大黄酸、7F、与Rac1及EGFR蛋白的相互作用;利用MTT法比较吉非替尼、大黄酸、7F抑制多种肿瘤活性及细胞毒性;Western Blot实验在蛋白水平验证7F对MDA-MB-231和MCF-7细胞中的EGFR、Rac1等蛋白的调控作用;2.以三阴性乳腺癌MDA-MB-231和低转移MCF-7乳腺癌及正常的乳腺上皮细胞为研究对象,通过MTT及CCK-8法确定7F对各种肿瘤细胞的毒性,利用克隆形成实验观察7F对细胞的增殖能力的影响,利用HE染色技术、电镜观察细胞的形态学以及细胞器超微结构变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布。Western Blot从蛋白水平检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Survivin、PARP的表达变化,最终确定7F诱导细胞的死亡模式。3.划痕和侵袭实验技术研究7F抑制MDA-MB-231细胞运动浸润转移的能力,血管生成实验探究7F对于细胞血管生成能力的影响,Western Blot检测EMT相关蛋白变化包括β-catenin,Vimentin,Snail,E-cadherin和基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-7,MMP-9。最终确定7F抑制细胞浸润转移的活性及相关的机制。结果:1.大黄酸、吉非替尼、7F分别与EGFR蛋白对接的结合能分值为-16.330Kcal/mol、-27.211 Kcal/mol,-35.325Kcal/mol,7F、大黄酸、吉非替尼与Rac1的结合能分值分别是-31.215Kcal/mol、-12.759Kcal/mol、-25.953kcal/mol,分值越低,蛋白结合能力越强;7F对不同肿瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性,其抑制卵巢癌、肝癌、骨肉瘤及乳腺癌细胞增殖的IC50值均较低,优于大黄酸和吉非替尼;同时7F对正常乳腺细胞MCF-10A的IC50高于三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC50,显示了一定的选择性。Western Blot结果显示,随着7F浓度增加,MDA-MB-231细胞中EGFR和P-EGFR的蛋白表达降低。在MCF-7细胞中,当7F浓度为8μM时,EGFR蛋白表达降低。随着7F浓度增加,MCF-7细胞中,P-EGFR的蛋白表达降低。2.7F作用乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞48 h后IC50值分别为（2.53±0.83）μM、（7.54±1.25）μM;克隆形成实验结果显示7F能显著抑制细胞的增殖能力;7F对细胞周期分布及凋亡率有明显影响,随着药物浓度增大,逐渐阻滞MDA-MB-231细胞周期于G2/M期,7F浓度为0、1、2、4μM时,MDA-MB-231的凋亡率依次为（5.23±1.44）%、（33.99±1.56）%、（77.37±3.55）%、（89.37±5.19）%,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.001）。7F对于MCF-7细胞的周期无影响,在7F浓度为0、4、8、16μM时,MCF-7的凋亡率依次为（4.43±0.71）%、（30.91±4.01）%、（39.37±3.07）%、（51.10±3.84）%,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.001）。7F处理的两种乳腺癌细胞均出现细胞核皱缩,胞浆内容物减小,细胞体积减小,连接消失。电镜下可见细胞核边缘聚集,核仁碎裂,线粒体肿胀,嵴消失,线粒体出现明显的空泡。出现凋亡小体,呈现典型的细胞凋亡的形态学变化。随着化合物浓度的增加,两株细胞中的Survivin、Bcl-2等抗凋亡蛋白表达量降低,Bax等促凋亡蛋白表达量增加。而caspase-3、caspase-7、caspase-9等关键凋亡蛋白酶被激活,PARP被切割,蛋白表达量降低。并出现Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP等剪切型蛋白。推测7F通过诱导细胞凋亡抑制乳腺癌细胞的增殖。3.7F显著抑制MDA-MB-231细胞迁移及侵袭,并抑制血管生成拟态,同时抑制HUVECS细胞的侵袭迁移以及血管生成。Western Blot结果显示,随着药物浓度的增加,MDA-MB-231细胞中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-7、MMP-9均降低,Snail蛋白降低,EMT标志性蛋白β-catenin、Vimentin蛋白降低,E-cadherin蛋白升高,这说明7F逆转了MDA-MB-231细胞的上皮间质转化。结论:1.将天然产物优势结构蒽醌母核与药物活性基团喹唑啉拼合合成的7F是一种抗肿瘤活性优于先导化合物大黄酸的新型蒽醌喹唑啉杂合物;对于多种肿瘤有良好的抑制效果,可同时抑制EGFR和Rac1表达,可能是EGFR和Rac1蛋白双靶点小分子抑制剂。2.7F抑制乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞增殖,效果优于顺铂。其作用机制与调控Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP等蛋白表达,诱导细胞凋亡有关。3.7F可以显著抑制三阴性乳腺癌浸润转移,通过抑制肿瘤血管生成和抑制上皮间质转化而实现。