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研究背景和目的糖尿病合并下肢动脉粥样硬化是导致患者足部溃疡和下肢截肢、特别是高位截肢和再次截肢的主要原因,目前具有高发病率、高致残率和高致死率的特点,给个人、家庭和社会带来严重的后果。目前普遍认为动脉粥样硬化斑块是一种血管壁的炎症性疾病,其特征是动脉血管壁脂质堆积、免疫细胞的浸润以及纤维帽的形成。除了巨噬细胞,树突状细胞(Dendritic cells,DCs)也在病灶中存在且促进了动脉粥样硬化斑块的形成;外泌体是近年来的研究热点,外泌体(Exosome)是一种纳米级的细胞囊泡,几乎可以被所有类型的细胞分泌,已经有很多研究表明外泌体囊泡内含有许多成分,包括膜蛋白、脂类、RNA以及DNA等,外泌体一旦从细胞释放便可以进入到体液中并被其他细胞摄取,从而影响细胞的生物学过程;核转录因子KappaB(Nuclear Factor KappaB,NF-κB)是细胞中非常重要的转录调节因子,NF-κB可以通过刺激因子的活化诱导多种基因的表达并产生多种细胞因子参与炎症反应。因此,本研究旨在探讨来源于DCs的外泌体通过影响NF-κB通路参与动脉粥样硬化的作用和机制,从而为防治糖尿病患者下肢动脉粥样闭塞并发症提供依据。研究方法①从C57BL/6小鼠中分离获得骨髓树突状细胞(Bone marrow dendritic cells,BMDCs)并培养,采用超速离心法分别从BMDCs培养基以及经脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的成熟BMDCs培养基中分离获得外泌体。②将分离获得的外泌体经电镜扫描技术以及western blot验证。③构建CD63-GFP融合蛋白慢病毒载体并转染BMDCs细胞来筛选CD63-GFP 阳性的细胞并示踪外泌体。④采用两种模型:一种为Transwell共培养体系,即将BMDCs细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养;另一种为将分离的外泌体直接处理细胞。然后采用ELISA法检测TNF-α和IL-6的含量、western blot检测p100以及p105的磷酸化水平、qRT-PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA水平的表达;采用细胞免疫荧光观察外泌体摄取情况。⑤将分离提取的exosome经尾静脉注射到高脂诱导的糖尿病ApoE-/-db/db小鼠中,给予小鼠高脂饮食,连续注射12周,以ApoE-/-小鼠和db/db糖尿病小鼠为对照组。⑥采用试剂盒检测小鼠血浆中胆固醇、甘油三酯、葡萄糖以及胰岛素的含量。⑦取小鼠动脉,用免疫荧光检测动脉内皮外泌体摄取情况;采用油红O染色观察病灶脂肪厚度;提取组织蛋白并用western blot检测动脉血管内皮中p100和p105的磷酸化表达。实验结果①经电镜扫描可观察到直径约100nm的圆形或类圆形的结构,经western blot检测外泌体标志物CD63以及TSG101阳性,从而证实提取的为从细胞分离的外泌体。②共培养体系辅助共聚焦显微镜观察显示来源于BMDCs的外泌体能够被HUVEC摄取。③经LPS诱导的成熟BMDCs与未成熟的BMDCs外泌体中的TNF-α和IL-6相比无明显统计学差异;与单纯的HUVEC相比,BMDCs与HUVEC共培养后,HUVEC培养基中的TNF-α和IL-6含量明显升高(P<0.05),且成熟的BMCDs组更高(P<0.00),而用GW4869抑制BMDCs外泌体分泌后,TNF-α和IL-6含量明显下降(P<0.01);用从BMDCs直接分离的外泌体处理HUVEC后也能得到同样的结果。④HUVEC与BMDCs共培养后,HUVEC中p100和p105的磷酸化水平升高(P<0.05),而用外泌体抑制剂GW4869处理BMDCs后,p100和p105的磷酸化水平下降(P<0.05);用从BMDCs直接分离的外泌体处理HUVEC后也能得到同样的结果。⑤与单纯HUVEC与BMDCs共培养组相比,共培养组联合NF-κB抑制剂BAY11-7082组HUVEC中p100和p105磷酸化水平降低(P<0.00),同时,TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平均降低(P<0.05)。⑥ApoE-/-小鼠、db/db小鼠以及ApoE-/-db/db小鼠血浆中胆固醇的含量分别为(266±22)mg/dl、(79±12)mg/dl 和(557±63)mg/dl;甘油三酯的含量分别为(60±8)mg/dl、(66±12)mg/dl 以及(216±19)mg/dl;ApoE-/-小鼠、db/db 小鼠以及ApoE-/-db/db小鼠血浆中葡萄糖的含量分别为(240±16)mg/dl、(512±42)mg/dl 和(478±23)mg/dl;胰岛素的含量分别为(0.3±0.05)ng/ml、(3.5±0.3)ng/ml 以及(4.2±0.5)ng/ml。⑦动物实验表明经尾静脉注射的来源于BMDCs的外泌体可以被小鼠动脉内皮细胞摄入;与对照组相比,外泌体处理组小鼠血管组织中的p100和p105磷酸化水平升高(P<0.05),同时,油红O染色表明外泌体处理组小鼠动脉血管脂肪层变厚(P<0.01)。实验结论①来源于BMDCs的外泌体能够被内皮细胞摄取并激活内皮细胞中的NF-κB信号通路以及促进促炎因子TNF-α和IL-6的表达和分泌②来源于BMDCs的外泌体可以促进糖尿病ApoE-/-db/db小鼠动脉内皮脂肪的堆积,从而进一步促进动脉粥样硬化的发生发展。③对于防治糖尿病合并下肢动脉粥样硬化尚需要进一步研究。