[背景]　　 围生期缺氧性脑损伤对患儿最长远的危害是神经系统后遗症，主要发生在中度以上缺氧缺血性脑病。2005年世界卫生组织资料显示，全球每年仍有400万新生儿死亡，与窒息相关者23％[1]，欧美等发达国家，中高度新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)的死亡和严重伤残率也高达53％～61％[2]，而发展中国家的状况远甚于此。我国每年出生的新生儿中，有30万左右的窒息新生儿，因为缺氧缺血性脑病遗留永久性脑损害如脑瘫、癫痫、智力低下、视听障碍等临床后遗症，导致不同程度的残疾[3]，给家庭和社会造成了极大的危害。　　 HIE是围生期窒息后引起的最常见和严重的并发症，90％发生在出生前和出生时，其中出生前因素约占20％，如母体大出血后继发血压过低，妊高症，胎盘异常以及胎儿宫内发育迟缓等。出生时的因素约占70％，如难产，宫内窘迫，脐带打结绕颈等。生后的因素约占10％，如有严重的肺部疾患，包括呼吸窘迫综合征、呼吸暂停以及先天性心脏病等[4]。　　 1、缺氧缺血性脑损伤　　 新生儿窒息导致脑损伤的高峰不是出现在缺血的当时，而是发生在恢复血流供应或侧支循环建立，即再灌注之后，机体继发一系列的代谢连锁反应，进一步加重脑损伤[5]。其机制除了兴奋性氨基酸及其毒性;氧自由基损伤作用;钙离子平衡紊乱;一氧化氮的毒性作用;体液因子(β-内啡肽、加压素、血小板活化因子(PAE)、心钠素、单胺类神经介质等）;细胞信号转导、线粒体损伤、细胞凋亡、免疫炎症损伤外，还涉及p53、bcl-2、bax、c-fos等多个基因的表达与调控[6、7]。　　 2、中枢神经系统细胞凋亡　　 细胞凋亡(Apotosis)又称程序化细胞死亡（programmed cell death），是细胞生命的基本特征之一。作为一种新的细胞死亡概念已引起广泛的兴趣，并日益受到重视。近年来由于生物技术的广泛应用，越来越多的研究表明，在脑缺血性损伤中凋亡起着重要作用。　　 新生几窒息经心肺复苏后很快恢复正常，但几小时后可出现迟发性脑损伤，其发生机理尚不清楚。在对窒息的新生儿大脑细胞进行检测时发现，脑细胞有明显的凋亡迹象，说明这种短暂脑缺氧缺血后出现的迟发细胞死亡机制中，可能至少部分与凋亡程序不适当的激活有关。凋亡的特征在新生猪缺氧缺血脑损伤中可见到，说明缺氧缺血发生迟发脑损伤时，大量细胞发生凋亡[8]。在未成熟和成熟大鼠缺氧及神经元缺氧体外实验中也可见到细胞凋亡的特征。缺氧缺血的程度与48h后发生凋亡的细胞比例之间存在正相关[9]。　　 缺氧缺血引起细胞凋亡的机理还不十分清楚。可能是经多种不同或互相重叠的途径，包括DNA损伤，细胞内Ca2+浓度的增加，其他的细胞结构的破坏，生存信号受损伤，细胞分泌功能下降，膜受体的损伤，或细胞内信息传递途径被干扰破坏，引起HIE的一些物质，如谷氨酸、NO在某些条件下启动细胞凋亡，提示最初的缺氧缺血未能引起急性坏死的脑细胞，可于若干小时后发生凋亡。缺氧缺血后同样可引起大脑细胞坏死，研究证实，脑缺氧缺血再灌注时，在缺氧缺血核心区凋亡和坏死的比率是1∶9，而在缺氧缺血半暗带比率为1∶6，而在脑缺氧缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主[10-12]。凋亡和坏死两者对治疗的反应不同，心肺复苏后12h内脑温度降低3℃，可明显减轻凋亡细胞的比例，但对细胞坏死则无影响[13、14]。　　 3、c-fos原癌基因　　 人类c-fos基因定位于人染色体长臂（14q21-31），为长度3.5kb的DNA，由4个外显子和3个内含子组成。c-fos原癌基因的特征为静止的细胞在受到外界刺激时能快速瞬间的表达。正常情况下，在中枢神经系统c-fos基因表达水平很低，难以检测，当受到如缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等，可激活c-fos基因，转录形成2.2 kb mRNA，进入胞浆后，其编码380个氨基酸，合成分子量为55kD的核内磷酸化蛋白，即Fos蛋白[15]。Fos蛋白的功能区域在进化中非常保守，该区是α螺旋，每3～4个氨基酸环绕1圈，每隔7个氨基酸就有1个亮氨酸，形成Fos的亮氨酸拉链(leucinezipper)[16]。Fos蛋白被认为是在外界刺激与转录偶联的信息传导过程中起着核内第三信使的作用，可以通过免疫组化方法检测出来。c-fos基因功能不是通过直接与DNA链结合来刺激基因的表达，而是通过其编码的核蛋白Fos实现的。各种细胞外刺激信号通过Ca2+、cAMP等第二信使激活转录因子，诱导c-fos基因转录，合成Fos蛋白，与另一原癌基因c-jun的核磷蛋白Jun蛋白通过“亮氨酸拉链”形成异源二聚体，与目的基因内的转录因子激活蛋白(activator protein-1，AP-1)调节位点一TGACTA结合，进一步激活目的基因的表达而最终对刺激做出反应，调节许多长程迟发反应基因的表达，参与信号转导[17]。因此c-fos基因被称为“第三信使”[18、19]。　　 4、c-fos原癌基因的表达与细胞凋亡　　 有研究认为c-fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一[20]。脑缺氧缺血后c-fos基因在神经细胞内的高表达和神经细胞凋亡关系密切。一些动物实验中c-fos基因表达与凋亡神经细胞在分布、时程、数量上的相关性证实了c-fos基因表达程度越高，相应的脑组织损伤越严重。其机制可能与c-fos基因表达后形成AP-1，通过调控其下游靶基因，从而使一些维持细胞生存的蛋白合成减少，杀手蛋白增加，最终导致细胞凋亡。　　 但也有另外一些研究报道，c-fos基因表达上调后，通过影响神经生长因子、过氧化物歧化酶等促神经细胞存活相关基因的表达，促使神经细胞对刺激、损伤产生不同的适应性变化，增强神经元的修复能力，从而发挥抗凋亡作用。还有研究认为，细胞凋亡的形态学和生化学发生变化迟于c-fos基因快速和大量表达的时间点。持续性c-fos基因高表达的神经细胞出现了不可逆性凋亡的病理改变，因此被认为可作为细胞凋亡启动的标志和神经元激活的早期标志[21]。　　 5、斑马鱼缺氧脑损伤模型　　 关于c-fos基因在脑缺氧缺血后神经细胞凋亡关系的研究仍存在不足之处。目前的研究多集中于应用不同类型的缺氧缺血模型，观察c-fos基因表达的时效、量效以及脑内分布等特点。本实验在新型模式生物体内斑马鱼中开展。在过去的十年中，越来越多的科学家都使用斑马鱼来制造疾病模型深入研究发病机制[22]。研究人员在利用斑马鱼对疾病过程深入研究中发现，它与啮齿类动物显示出良好的相关性，斑马鱼实验是一个潜在的啮齿类动物实验的替代品[23、24]。它是体外受精的动物，早期胚胎是透明的，透过电子显微镜可清楚观察胚胎发育过程中的变化，而且生长和发育迅速，它的基因与人类基因的相似度达到87％，意味着利用这种新型的模式生物，有望从基因水平针对c-fos相关靶基因进行干预调控，进一步实现对缺氧后c-fos基因及其表达的深入研究。　　 [目的]　　 缺氧缺血后的神经功能障碍与伤后神经细胞的死亡有关，包括坏死和凋亡，尤其是细胞凋亡，由于其发生较晚且持续时间较长，故对神经功能的影响更为显著。研究认为c-fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一。为了进一步探讨c-fos基因与脑缺氧缺血后神经细胞凋亡的关系，为探寻新的脑缺氧缺血治疗切入点、发现用药的有效时间窗提供有力的实验依据。本实验在新型模式生物体内斑马鱼中开展，观察缺氧后对受试动物脑细胞凋亡情况及c-fos基因表达水平的影响，探究缺氧缺血后抑制神经凋亡发生的方法，期望为临床上治疗和预防新生儿缺氧缺血性脑病提供新的思路。　　 [方法]　　 取48hpf的斑马鱼胚胎进行缺氧实验，模拟新生儿缺氧脑损伤环境，通过向水中通入99.999％高纯氮气制造缺氧环境，经过6h、12h及24h的缺氧处理后，采用吖啶橙染色方法，观察不同缺氧时间对斑马鱼神经细胞的凋亡的影响，同时采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCRdetecting system，qPCR)和原位杂交技术，对c-fos基因表达情况进行定量分析，比较缺氧前后c-fos基因表达水平的变化。　　 [结果]　　 对照组脑部能检测到微量细胞凋亡，c-fos基因呈低水平表达;实验组经过6h，12h及24h缺氧后，脑部凋亡细胞逐渐增多，缺氧24h组凋亡细胞增幅最大(P＜0.05)，c-fos基因表达有不同程度升高(P＜0.05)，尤其是缺氧6h后，该基因的表达上调幅度最高。　　 [结论]　　 通过缺氧能成功诱导48hpf斑马鱼胚胎发生神经细胞凋亡，产生脑损伤。缺氧会导致48hpf斑马鱼胚胎脑细胞内c-fos基因表达上调，可能是导致缺氧后期，其脑细胞凋亡激增的机制之一。本项研究首次对斑马鱼缺氧再灌注后c-fos基因进行了分析，丰富了对斑马鱼缺氧脑损伤的研究，结合前人对其他模式动物缺氧后c-fos基因表达的研究结果，为进一步制作斑马鱼缺氧脑损伤模型及研究c-fos基因在缺氧后细胞凋亡形成中的作用奠定了基础。