论文部分内容阅读
第一部分铁蓄积对小鼠、成骨细胞中mTOR水平及小鼠骨量的影响目的:研究铁蓄积—mTOR表达之间的关系,探索mTOR在铁蓄积骨质疏松中可能存在的作用。方法:1、动物实验:制作外源性铁蓄积小鼠模型,将20只8周龄野生(Wt)雄性小鼠(C57/BL6)随机分为两组,分别腹腔注射枸橼酸铁胺(Wt+FAC组,n=10)和生理盐水(Wt+Saline组,n=10),FAC和Saline使用均为40mg/kg,每周3次,持续两月;制作内源性铁蓄积小鼠模型,将10只8周龄铁调素敲除(△Hep)的转基因雌性小鼠和10只8周龄野生(Wt)雌性小鼠予以卵巢切除(OVX),分别为△Hep+OVX组、Wt+OVX组,饲养两月。两月后检测上述小鼠的体重并取血清和骨组织标本。血清铁蛋白(Fer)、mTOR浓度采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。肝脏和股骨行普鲁士蓝(Perls)铁染色,电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测肝铁含量,股骨微型计算机断层扫描(Micro-CT)检测骨量及骨密度(BMD)后用电感耦合等离子体发射质谱仪(ICP-MS)测量骨铁含量。胫骨mTOR基因表达、蛋白表达分别采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹实验(Western Blot)检测。2、细胞实验:实验组将h FOB1.19细胞、RAW264.7细胞用含200μM、50μM浓度FAC的培养基进行干预72h(iron组),对照组用磷酸盐缓冲液(PBS)干预(cont组)。两组细胞培养基中铁离子浓度用ELISA法检测,mTOR基因表达、蛋白表达分别采用RT-PCR、Western Blot检测。结果:1、在体研究:各组小鼠体重无统计学差异(p>0.05)。在外源性FAC干预后,Wt+FAC组较Wt+Saline组,血清Fer浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显著增加(p<0.05),同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显著上升(p<0.05)。在内源性铁调素敲除后,△Hep+OVX组较Wt+OVX组,血清铁蛋白浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显著增加(p<0.05),同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显著上升(p<0.05),而且骨量、BMD明显减少(p<0.05)。2、离体研究:在外源性FAC干预后,h FOB1.19细胞培养基中铁离子浓度明显增加(p<0.05),同时mTOR基因表达、蛋白表达均显著上升(p<0.05)。RAW264.7细胞培养基中铁离子浓度较对照组cont组明显增加(p<0.05),但mTOR基因表达、蛋白表达两组均无显著差异(p>0.05)。结论:mTOR水平伴随铁浓度增加而上升,铁蓄积可能通过增加的mTOR促进OVX小鼠骨量丢失形成“铁蓄积骨质疏松”。第二部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的骨生成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapa)对铁蓄积高转换骨质疏松中骨生成的影响。方法:1、动物实验:将16只8周龄野生(Wt)雌性小鼠和48只8周龄铁调素敲除(△Hep)的转基因雌性小鼠予以卵巢切除(OVX),分为四组(Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组和△Hep+OVX+Rapa组)。Rapa为腹腔注射,3mg/kg/day,持续两月。CMC为Rapa溶剂,注射剂量及持续时间同Rapa。末次注射结束后四组小鼠处死取血清和骨组织标本。用股骨微型计算机断层扫描(Micro-CT)检测股骨骨量及骨密度(BMD)等参数,扫描电镜(SEM)、H-E染色检测骨量及骨小梁结构,碱性磷酸酶(ALP)染色检测成骨细胞骨形成能力,生物力学实验检测股骨弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数,血清成骨指标(ALP、PINP、Ocn)采用ELISA检测,成骨基因(Runx2、SP7、ALP)表达采用RT-PCR检测。2、细胞实验:将h FOB1.19细胞分为四组(cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组),cont组作为对照组,iron组用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h,iron+si-MT组和iron+si-NC组为成骨细胞分别行mTOR特异性si RNA转染和空白转染后再用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h。用碱性磷酸酶(ALP)染色检测成骨细胞活性,用茜素红染色(ARS)检测成骨细胞骨矿化能力,成骨基因(Runx2、SP7、ALP)表达采用RT-PCR检测,成骨蛋白(Runx2,Ocn)表达用Western Blot检测。结果:1、在体研究:股骨Micro-CT显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D明显减少,TB.Sp、SMI明显增加,而△Hep+OVX+Rapa组较△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D增加,TB.Sp、SMI减少(p<0.05)。股骨电镜、胫骨HE染色显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组骨量及骨小梁明显减少,使用雷帕霉素后骨量及骨小梁明显改善(p<0.05),胫骨ALP染色亦表明△Hep+OVX组使用雷帕霉素后成骨细胞骨形成明显增加(p<0.05)。生物力学显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数明显降低,注射雷帕霉素后明显恢复(p<0.05)。与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组血清成骨指标(ALP、PINP、Ocn)、骨组织成骨基因(Runx2、SP7、ALP)表达明显减少,雷帕霉素干预后明显增加(p<0.05)。2、离体研究:ALP染色和茜素红染色显示,与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨细胞活性及矿化能力明显下降,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显改善(p<0.05)。与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨基因(Runx2、SP7、ALP)和成骨蛋白(Runx2,Ocn)表达明显降低,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显恢复(p<0.05)。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以提高骨量及成骨活性,具有改善骨生成作用。第三部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的血管形成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapa)对铁蓄积高转换骨质疏松中血管形成的影响。方法:1、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot分别检测骨组织中促血管生成Slit3基因及蛋白表达水平。备用胫骨作冰冻切片,血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)抗体、内皮粘蛋白(EMCN)抗体双染,共聚焦显微镜观察H亚型血管数目及分布。2、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。用划痕实验、小管形成实验分别检测HUVEC迁移能力、管形成能力,免疫荧光检测各组HUVEC中EMCN表达情况。结果:1、在体研究:与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组Slit3基因表达、蛋白表达、H亚型血管数目及分布明显减少,使用雷帕霉素后明显增加(p<0.05),但△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异(p>0.05)。2、离体研究:与cont组培养基培养的HUVEC相比,iron组和iron+si-NC组培养基培养的HUVEC其迁移能力、管形成能力明显抑制,EMCN表达明显减少,iron+si-MT组上述指标明显恢复(p<0.05)。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以促进Slit3基因表达、蛋白表达、增加H亚型血管数目及分布,mTOR抑制后HUVEC活性增强,具有改善血管形成作用。第四部分雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的机制研究目的:研究雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的作用机制。方法:1、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同HUVEC。RT-PCR、Western Blot(或ELISA)检测细胞中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR(VEGF受体)、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。免疫荧光检测成骨细胞和HUVEC中KDR的磷酸化水平。2、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot检测骨组织中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR(VEGF受体)、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。结果:1、离体研究:h FOB1.19细胞在接受FAC干预后(即iron组)mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在mTOR特异性si-RNA转染后(即iron+si-MT组),上述指标明显恢复(p<0.05)。iron组和iron+si-NC组无明显差异(p>0.05)。2、在体研究:铁调素敲除的转基因去卵巢小鼠(即△Hep+OVX组)较Wt+OVX组,骨组织中mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在使用雷帕霉素后(即△Hep+OVX+Rapa组),上述指标明显恢复(p<0.05)。△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异(p>0.05)。结论:铁蓄积通过mTOR/STAT1/Cxcl9通路,抑制p KDR,使VEGF及KDR有效结合减少,从而影响高转换骨质疏松骨量恢复。雷帕霉素可以靶向mTOR,改善“骨生成/血管形成”,具有成骨作用。