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鼻咽癌是一种在中国南方,东南亚及北非一些国家中高发的上皮恶性肿瘤。鼻咽癌的病因被认为与遗传易感性、EB病毒感染以及其他一些环境因素密切相关。根据世界卫生组织(WHO)的分型标准可将鼻咽癌分为角化性鳞状细胞癌、分化型非角化性癌以及未分化型非角化性癌。在鼻咽癌高发地区——中国南方,90%的鼻咽癌患者均为未分化型非角化性癌,且几乎所有未分化型非角化性鼻咽癌患者均携带有EB病毒感染。
p63是一个与p53有着高度同源性的p53家族新成员,它与p53有着结构与功能上的相似性,同时也有许多不同之处。p63对于上皮细胞的发育和分化非常重要,同时,在许多肿瘤中都观察到p63的高表达,尤其是那些分化程度低的恶性肿瘤。本研究的主要目的即为检测p63在鼻咽癌中的表达并进一步对引起其高表达的机理进行探索。
本论文首先通过免疫组化在一张有248例鼻咽标本的组织芯片上研究了p63在鼻咽癌及鼻咽部非癌组织中的表达,结果发现p63在202例未分化非角化性鼻咽癌组织中100%呈阳性表达,而在29例鼻咽炎症组织及17例鼻咽癌旁上皮组织中为阴性表达。为了进一步明确p63表达与鼻咽癌不同分化程度之间的关系,我们分析了106例不同分化类型的鼻咽癌组织,其中有8例角化性鼻咽癌,48例分化型非角化性鼻咽癌和50例未分化型非角化性鼻咽癌。p63在所有的鼻咽癌标本都为阳性表达,且p63阳性表达的强度与鼻咽癌的分化程度密切相关。p63在角化性鼻咽癌、分化型非角化性鼻咽癌及未分化型非角化性鼻咽癌中的强阳性表达率分别为62.5%(5/8)、92.5%(43/48)、及100%(50/50)。在角化性鼻咽癌及非角化性鼻咽癌中存在显著性差异(p=0.001)。
在明确了p63在鼻咽癌中呈阳性表达以及其表达强度与鼻咽癌分化程度密切相关之后,我们对其高表达的分子机理进行了进一步的探讨。首先,我们对p63基因进行了突变分析,看其是否因为基因突变丧失活性,导致蛋白质结构发生改变,聚集在核内而呈现出高表达。由于鼻咽组织的复杂性,我们对鼻咽癌组织标本采取了克隆测序的策略。而对其匹配的血标本采取PCR直接测序的方法。通过对p63基因14个外显子的测序,我们均未发现其在鼻咽癌中有突变发生,说明p63在鼻咽癌中的高表达并非由其基因突变所导致。
p63基因在鼻咽癌中没有发生突变,说明p63的高表达可能另有原因。在以往的研究中,人们发现p53蛋白在一些肿瘤中可能因为与病毒编码的蛋白质相互作用而导致活性丧失,从而导致p53呈现出高表达。另一方面,EB病毒感染被证实与鼻咽癌的发生有着密切联系。而有报道称EBNA-5与p53能在细胞核内发生相互作用。因此,我们对p63和ENBNA-5进行了免疫共沉淀试验,证实了二者在鼻咽癌细胞内能相互结合。同时,我们对携带有EBV及未携带EBV的细胞株进行了半衰期分析,发现有EBV的细胞株中p63的半衰期明显高于没有EBV的细胞株,说明p63与EBNA-5的结合可能是导致p63在鼻咽癌中呈现高表达的原因。
此外,我们还用半定量RT-PCR对p63不同异构体在鼻咽癌中的表达进行了分析,发现TA-和△N-型p63这两大类异构体在mRNA水平上均有表达,但△Np63的表达占主导地位。我们还应用染色质免疫共沉淀方法(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)对p63下游因子进行了分析。ChIP结果表明p63作为一个转录因子,能与p21以及14-3-3σ的启动子区域结合,从而对其起到一定的调控作用。
本研究观察到p63在鼻咽癌中有高度表达,且其表达强度与鼻咽癌分化程度密切相关。免疫共沉淀试验证实p63能在鼻咽癌细胞中与EBNA-5发生相互作用,二者的结合可能是导致p63在鼻咽癌中高表达的原因。我们的试验结果提示p63可作为一个有效的鼻咽癌标记物应用于临床诊断,同时也为进一步理解EB病毒感染在鼻咽癌发病过程中起作用的方式提供了一个新的思路。