【摘 要】
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目的:本研究主要基于H2O2诱导的体外心肌细胞损伤模型研究MiR-199a-3p在心肌损伤中的作用及机制,为阐明MiR-199a-3p在调节MI引起的心肌损伤中的机制及治疗研究提供新的思路和方向。方法:分别给与人心肌细胞AC16细胞和原代小鼠（C57BL/6）心肌细胞（MPC）不同浓度及时间H2O2处理,构建心肌细胞体外损伤模型。通过RT-qPCR、Western blot（WB）检测H2O2处理
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目的:本研究主要基于H2O2诱导的体外心肌细胞损伤模型研究MiR-199a-3p在心肌损伤中的作用及机制,为阐明MiR-199a-3p在调节MI引起的心肌损伤中的机制及治疗研究提供新的思路和方向。方法:分别给与人心肌细胞AC16细胞和原代小鼠（C57BL/6）心肌细胞（MPC）不同浓度及时间H2O2处理,构建心肌细胞体外损伤模型。通过RT-qPCR、Western blot（WB）检测H2O2处理对心肌细胞MiR-199a-3p及其靶基因、凋亡相关蛋白（BCL-2、BAX和c-Caspase3）表达的影响。为了研究MiR-199a-3p对H2O2处理的心肌细胞生物学功能的影响,使用MiR-199a-3p mimics和MiR-199a-3p inhibitors转染心肌细胞来过表达和抑制MiR-199a-3p的表达。使用CCK8法、5-Ethynyl-2’-deoxyuridline（Ed U）、WB和流式细胞术检测H2O2处理MiR-199a-3p mimics和inhibitor转染对心肌细胞增殖和凋亡水平的影响。为预测MiR-199a-3p的潜在靶基因,使用Targetscan在线生物信息数据库分析MiR-199a-3p靶基因及作用位点。为明确NACC2在H2O2诱导的心肌损伤中的作用,首先采用WB分析MiR-199a-3p靶基因NACC2相应H2O2处理的表达变化。然后,使用si RNA抑制NACC2的表达后通过CCK8实验、流式细胞术、WB检测NACC2表达抑制对H2O2诱导下心肌细胞增殖和凋亡水平的变化。为了验证MiR-199a-3p对H2O2诱导的心肌细胞增殖及凋亡的影响机制,所以靶向抑制NACC2表达,使用包含MiR-199a-3p与NACC2预测结合位点序列及突变序列的双荧光素酶报告质粒来验证MiR-199a-3p与NACC2的调控关系及潜在相互作用位点。最后,使用MiR-199a-3p mimics质粒与NACC2过表达质粒（OE-NACC2）进行拯救实验,验证MiR-199a-3p对H2O2诱导的心肌细胞增殖及凋亡的影响是通过靶向抑制NACC2表达来调节。结果:qPCR和CCK8实验显示MiR-199a-3p的表达以及MPC和AC16细胞的细胞活力在100μM H2O2处理24h后最低。H2O2诱导后心肌细胞活力显著降低,凋亡水平显著升高。CCK8和Ed U实验显示,H2O2处理显著抑制了MPC和AC16细胞的细胞增殖,抑制了抗凋亡蛋白BCL-2表达和促进了凋亡相关蛋白Bax、c-Caspase3的表达;而转染了MiR-199a-3p mimics后部分修复了H2O2引起的细胞增殖和凋亡的失调。在线生物信息学分析结果发现NACC2是MiR-199a-3p的靶基因之一。并且qPCR和Western blot结果表明,NACC2与MiR-199a-3p的表达趋势相反,随着H2O2浓度升高,NACC2的表达逐渐升高。使用MiR-199a-3p mimics过表达细胞MiR-199a-3p可下调NACC2的表达。转染MiR-199a-3p mimics抑制转染了野生型NACC2质粒（WT）的细胞的荧光素酶活性,而不能抑制转染了突变NACC2的质粒（MUT）的细胞的荧光素酶活性。进一步分析NACC2的功能发现,NACC2的表达抑制显著提升了H2O2诱导的MPC和AC16细胞活力,抑制了H2O2诱导的细胞凋亡。最后,使用质粒转染过表达NACC2促进H2O2处理所导致的心肌细胞活力下降;而MiR-199a-3p mimics可改善H2O2导致的细胞活力下降及NACC2对H2O2处理所导致的心肌细胞活力下降的增强效应。结论:MiR-199a-3p通过靶向抑制NACC2的表达,从而促进心肌损伤细胞的增殖,显著改善了H2O2诱导的心肌细胞损伤。
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