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目的：
本研究采用网络药理学分析墨旱莲中具有抗结直肠癌活性的关键化合物，并通过活性追踪的化学成分分离方法进行验证，进而对墨旱莲抗结直肠癌的活性进行评价，并明确其物质基础。通过网络药理学预测墨旱莲中抗结直肠癌活性成分的关键靶点，并结合分子生物学实验进行验证，初步研究其影响结直肠癌细胞生物学的相关机制，为墨旱莲抗结直肠癌的临床应用提供新的实验依据。
方法：
检索建立墨旱莲化学成分数据库并预测靶点，结合检索得到的结直肠癌疾病靶点构建网络，利用String数据库获得蛋白-蛋白相互关系，并进行GO分析和KEGG分析，预测其关键靶点和关键成分，对关键成分和关键靶点进行分子对接验证成分与靶点间的结合能力。采用常温渗漉和萃取技术对墨旱莲药材进行提取和初步分离，并建立了DSS诱导的小鼠慢性结直肠炎模型，对墨旱莲乙醇提取物不同极性部位进行抗慢性结肠炎活性评价。并结合体外实验，采用CCK-8法检测墨旱莲乙醇提取物不同极性部位对结直肠癌细胞株HCT-116和DLD-1的增殖影响。判断墨早莲能否通过抑制炎症从而减少结直肠癌的发生，以及能否直接抑制结直肠癌的增殖。
采用高速逆流色谱技术对墨旱莲乙醇提取物乙酸乙酯部位进行分离，并结合结直肠癌细胞株HCT-116和DLD-1的体外增殖模型对其活性成分进行追踪。再次通过网络药理学手段预测活性成分的作用靶点，并进行分子对接和分子生物学验证。采用流式细胞仪Annexin V-ΒE/7ADD染色技术探究细胞凋亡率的变化;采用ΒCR法检测细胞雌激素受体（ERβ1、ERβ2、ERβ4和ERα）的表达水平;并采用Western blot法检测ΒI3K/AKT/NF-KB细胞信号通路相对应的蛋白表达水平的变化情况。
结果：
通过网络药理学分析，对墨旱莲中104种成分进行了靶点预测，得到作用于结直肠癌疾病的5个关键成分刺槐素、芹菜素、香叶木素、木犀草素和蟛蜞菊内酯。通过DSS诱导的小鼠慢性结直肠炎模型，发现EEE(生药量10g/kg)能减少炎症导致的小鼠肠道炎症浸润及肠道组织溃疡，肠道病理组织评分显著优于模型组(Β＜0.06)。小鼠肠道菌群16S-DNA检测和ΒLS-DA分析结果显示，DSS诱导的结直肠炎会对小鼠肠道菌群产生显著改变，并且ΒEE(生药量10g/kg)和EEE(生药量110g/kg)能对DSS小鼠的肠道菌群产生改变。通过体外模型的评价，发现墨旱莲乙酸乙酯部位给药48h对人结直肠癌细胞株HCT-116（IC50=31.74μg/mL）和DLD-I(IC50=21.77μg/mL)具有显著的体外增殖抑制作用。
针对EEE进行第一次高速逆流色谱分离，选择了石油醚-乙酸乙酯.甲醇-水体积比为3∶7∶5∶5的两相溶剂体系，从墨旱莲乙醇提取物乙酸乙酯相中分离得到3化合物，经鉴定为异去甲蟛蜞菊内酯、蟛蜞菊内酯和木犀草素。木犀草素（25μg/mL）仅对HCT-116细胞具有增殖抑制作用，48h抑制率为（40.88±2.28）％;蟛蜞菊内酯(25μg/mL)对HCT-116细胞和DLD-1细胞均有增殖抑制作用，48h抑制率分别为(39.14±1.84)％和（49.76±5.39）％;EEE尾吹部位（25μg/mL）对HCT-116细胞和DLD-1细胞均有增殖抑制作用，抑制率分别为（60.14±6.87）％和（86.8±6.72）％。针对EEE尾吹部位进行第二次高速逆流色谱分离，选择了正己烷，乙酸乙酯-甲醇-水体积比为10∶7∶10∶7的两相溶剂体系。从中分离得到2个峰，采用半制备高效液相色谱法，从峰A中分离得到1个化合物，其对HCT-116和DLD-1细胞具有较好的增殖抑制作用，48h的IC5。分别为11.58μmol/L和13.54μmol/L。
通过网络药理学分析对蟛蜞菊内酯作用于结直肠癌细胞凋亡的靶点进行预测，得到AKT1、EGFR、SRC、ESR1、PTGS2、MMP9、ERBB2、CDK1共8个关键靶点。结合通路路径分析，提示蟛蜞菊内酯可能通过雌激素受体1(ESR1)和蛋白激酶Bα(AKT1)相关通路诱导结直肠癌细胞凋亡，从而抑制其体外增殖。
通过CCK-8法，测定了不同浓度的蟛蜞菊内酯在48h和72h对HCT-116和DLD-1细胞的体外增殖抑制率。
结果表明，蟛蜞菊内酯对DLD-1细胞更为敏感，在药物作用48h和72h后，其IC50分别为77.43μmol/L和25.85μmol/L。流式细胞术检测发现，蟛蜞菊内酯（25μmol/L）作用48h后，能有效诱导DLD-1细胞凋亡（P＜0.01）。并且，雌激素拮抗剂氟维司群（50μmol/L）预处理4h后，联合蟛蜞菊内酯（25μmol/L）作用72h，能够显著阻断其对DLD-1细胞的增殖抑制作用(P＜0.05)，并且蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药48h后能显著降低DLD-1细胞ERβ2、ERβ4和ERα的mRNA表达水平（P＜0.05）。蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药组与空白对照组相比，能显著降低DLD-1细胞中AKTI蛋白磷酸化水平（0.72±0.27vs0.57±0.17，P＜0.05），并对AKTI的蛋白表达水平未产生显著影响。同时，发现蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药组与空白对照组相比，能显著抑制IKKα（0.65±0.09vs0.37±0.07，P＜0.05）和IKKβ（0.90±0.13vs0.62±0.19，P＜0.05）的蛋白表达，进而抑制P65蛋白的磷酸化水平（1.82±0.13vs1.34±0.16，P＜0.05）。
结论：
本研究发现墨旱莲中的木犀草素能显著抑制人结直肠癌细胞HCT-116的体外增殖，蟛蜞菊内酯能显著抑制人结直肠癌细胞HCT-116和DLD-1的体外增殖，并能诱导DLD-1细胞凋亡，其作用机制可能涉及雌激素受体以及PI3KJAKT/NF-κB相关信号通路。
本研究采用网络药理学分析墨旱莲中具有抗结直肠癌活性的关键化合物，并通过活性追踪的化学成分分离方法进行验证，进而对墨旱莲抗结直肠癌的活性进行评价，并明确其物质基础。通过网络药理学预测墨旱莲中抗结直肠癌活性成分的关键靶点，并结合分子生物学实验进行验证，初步研究其影响结直肠癌细胞生物学的相关机制，为墨旱莲抗结直肠癌的临床应用提供新的实验依据。
方法：
检索建立墨旱莲化学成分数据库并预测靶点，结合检索得到的结直肠癌疾病靶点构建网络，利用String数据库获得蛋白-蛋白相互关系，并进行GO分析和KEGG分析，预测其关键靶点和关键成分，对关键成分和关键靶点进行分子对接验证成分与靶点间的结合能力。采用常温渗漉和萃取技术对墨旱莲药材进行提取和初步分离，并建立了DSS诱导的小鼠慢性结直肠炎模型，对墨旱莲乙醇提取物不同极性部位进行抗慢性结肠炎活性评价。并结合体外实验，采用CCK-8法检测墨旱莲乙醇提取物不同极性部位对结直肠癌细胞株HCT-116和DLD-1的增殖影响。判断墨早莲能否通过抑制炎症从而减少结直肠癌的发生，以及能否直接抑制结直肠癌的增殖。
采用高速逆流色谱技术对墨旱莲乙醇提取物乙酸乙酯部位进行分离，并结合结直肠癌细胞株HCT-116和DLD-1的体外增殖模型对其活性成分进行追踪。再次通过网络药理学手段预测活性成分的作用靶点，并进行分子对接和分子生物学验证。采用流式细胞仪Annexin V-ΒE/7ADD染色技术探究细胞凋亡率的变化;采用ΒCR法检测细胞雌激素受体（ERβ1、ERβ2、ERβ4和ERα）的表达水平;并采用Western blot法检测ΒI3K/AKT/NF-KB细胞信号通路相对应的蛋白表达水平的变化情况。
结果：
通过网络药理学分析，对墨旱莲中104种成分进行了靶点预测，得到作用于结直肠癌疾病的5个关键成分刺槐素、芹菜素、香叶木素、木犀草素和蟛蜞菊内酯。通过DSS诱导的小鼠慢性结直肠炎模型，发现EEE(生药量10g/kg)能减少炎症导致的小鼠肠道炎症浸润及肠道组织溃疡，肠道病理组织评分显著优于模型组(Β＜0.06)。小鼠肠道菌群16S-DNA检测和ΒLS-DA分析结果显示，DSS诱导的结直肠炎会对小鼠肠道菌群产生显著改变，并且ΒEE(生药量10g/kg)和EEE(生药量110g/kg)能对DSS小鼠的肠道菌群产生改变。通过体外模型的评价，发现墨旱莲乙酸乙酯部位给药48h对人结直肠癌细胞株HCT-116（IC50=31.74μg/mL）和DLD-I(IC50=21.77μg/mL)具有显著的体外增殖抑制作用。
针对EEE进行第一次高速逆流色谱分离，选择了石油醚-乙酸乙酯.甲醇-水体积比为3∶7∶5∶5的两相溶剂体系，从墨旱莲乙醇提取物乙酸乙酯相中分离得到3化合物，经鉴定为异去甲蟛蜞菊内酯、蟛蜞菊内酯和木犀草素。木犀草素（25μg/mL）仅对HCT-116细胞具有增殖抑制作用，48h抑制率为（40.88±2.28）％;蟛蜞菊内酯(25μg/mL)对HCT-116细胞和DLD-1细胞均有增殖抑制作用，48h抑制率分别为(39.14±1.84)％和（49.76±5.39）％;EEE尾吹部位（25μg/mL）对HCT-116细胞和DLD-1细胞均有增殖抑制作用，抑制率分别为（60.14±6.87）％和（86.8±6.72）％。针对EEE尾吹部位进行第二次高速逆流色谱分离，选择了正己烷，乙酸乙酯-甲醇-水体积比为10∶7∶10∶7的两相溶剂体系。从中分离得到2个峰，采用半制备高效液相色谱法，从峰A中分离得到1个化合物，其对HCT-116和DLD-1细胞具有较好的增殖抑制作用，48h的IC5。分别为11.58μmol/L和13.54μmol/L。
通过网络药理学分析对蟛蜞菊内酯作用于结直肠癌细胞凋亡的靶点进行预测，得到AKT1、EGFR、SRC、ESR1、PTGS2、MMP9、ERBB2、CDK1共8个关键靶点。结合通路路径分析，提示蟛蜞菊内酯可能通过雌激素受体1(ESR1)和蛋白激酶Bα(AKT1)相关通路诱导结直肠癌细胞凋亡，从而抑制其体外增殖。
通过CCK-8法，测定了不同浓度的蟛蜞菊内酯在48h和72h对HCT-116和DLD-1细胞的体外增殖抑制率。
结果表明，蟛蜞菊内酯对DLD-1细胞更为敏感，在药物作用48h和72h后，其IC50分别为77.43μmol/L和25.85μmol/L。流式细胞术检测发现，蟛蜞菊内酯（25μmol/L）作用48h后，能有效诱导DLD-1细胞凋亡（P＜0.01）。并且，雌激素拮抗剂氟维司群（50μmol/L）预处理4h后，联合蟛蜞菊内酯（25μmol/L）作用72h，能够显著阻断其对DLD-1细胞的增殖抑制作用(P＜0.05)，并且蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药48h后能显著降低DLD-1细胞ERβ2、ERβ4和ERα的mRNA表达水平（P＜0.05）。蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药组与空白对照组相比，能显著降低DLD-1细胞中AKTI蛋白磷酸化水平（0.72±0.27vs0.57±0.17，P＜0.05），并对AKTI的蛋白表达水平未产生显著影响。同时，发现蟛蜞菊内酯（25μmol/L）给药组与空白对照组相比，能显著抑制IKKα（0.65±0.09vs0.37±0.07，P＜0.05）和IKKβ（0.90±0.13vs0.62±0.19，P＜0.05）的蛋白表达，进而抑制P65蛋白的磷酸化水平（1.82±0.13vs1.34±0.16，P＜0.05）。
结论：
本研究发现墨旱莲中的木犀草素能显著抑制人结直肠癌细胞HCT-116的体外增殖，蟛蜞菊内酯能显著抑制人结直肠癌细胞HCT-116和DLD-1的体外增殖，并能诱导DLD-1细胞凋亡，其作用机制可能涉及雌激素受体以及PI3KJAKT/NF-κB相关信号通路。