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椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)是导致腰背痛等症状的重要原因之一.随着医学的进步,人均寿命的延长,以及我国逐渐进入老龄化社会,IDD的发病率显著增高,严重影响患者的生活质量,也给社会带来沉重的医疗负担.椎间盘的退变开始于髓核的退变,髓核(nucleus pulposus tissue,NP)的退变表现在具有软骨样性质的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的主要成分聚蛋白多糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)逐渐减少,使髓核组织失去了原有的弹性模量而纤维化.当前,针对髓核组织的退变,无论是手术还是保守治疗,都存在着一些不足.因此,通过外源性物质的转导,在保留髓核组织的前提下,延缓甚至逆转髓核组织的退变是我们追寻的目标.本课题组前期的工作中将BMP9转导至永生化的鼠椎间盘细胞株内,发现表达聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA明显增加,所以我们猜测BMP9对人退变的髓核细胞是否也有类似的作用?本课题拟从以下四个方面进行阐述:1、人退变髓核细胞的提取、培养和鉴定;2、BMP9对人退变髓核细胞周期、增殖及细胞外基质的影响;3、BMP9与Notch信号通路的联系以及BMP9对髓核细胞内Notch信号的调控;4、dnNotch1、DLL1、Jagged1对人退变髓核细胞外基质的调控.
第一部分 人退变髓核细胞的提取、培养和鉴定
目的:探讨一整套完整的提取和培养人退变髓核细胞的方法,并对提取的细胞进行鉴定.
方法:收集在重庆医科大学附属第一医院骨科住院并经过开放性手术的患者所摘除的腰椎间盘组织标本,立即转移至细胞操作台.标本经过清洗、仔细分离,获得髓核组织.采用酶序贯消化法分离,获得细胞悬液后,接种至T25培养瓶,放入孵箱培养.采用免疫荧光法鉴定髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs).
结果:原代髓核细胞初步贴壁时间至少3天,汇合率达90%约需13-15天,而且髓核细胞培养条件要求比较高.免疫荧光检测细胞内同时有聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白存在,由此证明该细胞为髓核细胞.
结论:能通过酶序贯消化法提取纯净的髓核细胞并培养.
第二部分BMP9对人退变髓核细胞周期、增殖及细胞外基质的影响
目的:探讨BMP9对人退变髓核细胞周期、增殖及细胞外基质的影响.
方法:使用Ad-GFP和Ad-BMP9病毒感染P1代髓核细胞,BMP9为实验组,GFP作为对照组.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证BMP9表达成功;CCK-8检测BMP9对髓核细胞增殖的影响;流式细胞学检测BMP9对髓核细胞周期的影响.RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达量.
结果:经Ad-BMP9感染的髓核细胞内BMP9的表达量明显增多,而髓核细胞自身并不表达内源性BMP9.实验组内髓核细胞的增殖较对照组有统计学差异,且细胞G1期明显缩短,S期明显延长,G2-M期也有轻度延长.实验组内的聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达量均有明显增加,尤以聚蛋白多糖增加明显.
结论:BMP9能促进髓核细胞增殖,促进髓核细胞外基质表达.
第三部分BMP9与Notch信号通路的联系以及BMP9对髓核细胞内Notch信号的调控
目的:探讨BMP9与Notch信号通路的联系,了解髓核细胞内BMP9干预前后Notch信号受体和配体的变化.
方法:使用RT-PCR、Western blot检测BMP9干预后髓核细胞内Notch信号通路关键分子和靶基因的表达情况.随后通过RT-PCR检测BMP9干预后髓核细胞内Notch受体和配体的变化.
结果:BMP9干预后Notch信号通路的关键分子NICD-1(NICD活化形式之一)和靶基因hes1、hes5、hey2均减少,hey1、L无明显差异.未处理的髓核细胞内Notch信号的配体中以Jagged1表达最高, Jagged2、DLL3未表达.各受体均有不同程度表达,以Notch3表达最多.经BMP9干预后的髓核细胞内Notch1和DLL1减少,Notch4轻度上调,其余受体和配体未见明显变化.
结论:BMP9与Notch信号有紧密联系.
第四部分dnNotch1、DLL1、Jagged1对人退变髓核细胞外基质的调控
目的:探讨dnNotch1、DLL1、Jagged1对髓核细胞外基质的影响
方法:将dnNotch1、Jagged1、DLL1按如下分组①Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-BMP9+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-dnNotch1、Ad-BMP9+Ad-dnNotch1;②Ad-GFP+Ad-RFP 、 Ad-BMP9+Ad-RFP 、 Ad-GFP+Ad-Jagged1 、Ad-BMP9+Ad-Jagged1;③Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-BMP9+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1.各组分别干预髓核细胞,使用RT-PCR、Western blot检测聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达量,并进行组内对比.
结果:DLL1 组: 聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的 mRNA 表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1(P<0.05).Ad-GFP+Ad-DLL1和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1(P<0.05),Ad-GFP+Ad-DLL1和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).聚蛋白多糖:Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-DLL1(P<0.05),Ad-GFP+Ad-RFP和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).Ⅱ型胶原:Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05);
Jagged1 组 : 聚 蛋 白 多 糖 、 Ⅱ型 胶 原 的 mRNA 表 达 :Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-Jagged1、Ad-BMP9+Ad-Jagged1(P<0.05). Ad-GFP+Ad-Jagged1 和 Ad-BMP9+Ad-Jagged1无 统 计 学 差 异 (P > 0.05) . 聚 蛋 白 多 糖 的 蛋 白 表 达 :Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-Jagged1(P < 0.05). Ad-BMP9+Ad-Jagged1和Ad-GFP+Ad-RFP、 Ad-GFP+Ad-Jagged1和Ad-BMP9+Ad-Jagged1无统计学差异(P>0.05)
Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-BMP9+Ad-Jagged1>Ad-GFP+Ad-Jagged1.
dnNotch1 组: 聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1>Ad-GFP+Ad-dnNotch1>Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP有统计学差异(P<0.05)(图 4-11).聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1、Ad-GFP+Ad-dnNotch1>Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP(P<0.05).聚蛋白多糖:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1>Ad-GFP+Ad-dnNotch1 有统计学差异(P<0.05).Ⅱ型胶原:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1 和Ad-GFP+Ad-dnNotch1 无统计学差异(P>0.05).
结论:dnNotch1能显著促进髓核细胞表达聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原,而DLL1和Jagged1相反起抑制作用.
第一部分 人退变髓核细胞的提取、培养和鉴定
目的:探讨一整套完整的提取和培养人退变髓核细胞的方法,并对提取的细胞进行鉴定.
方法:收集在重庆医科大学附属第一医院骨科住院并经过开放性手术的患者所摘除的腰椎间盘组织标本,立即转移至细胞操作台.标本经过清洗、仔细分离,获得髓核组织.采用酶序贯消化法分离,获得细胞悬液后,接种至T25培养瓶,放入孵箱培养.采用免疫荧光法鉴定髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs).
结果:原代髓核细胞初步贴壁时间至少3天,汇合率达90%约需13-15天,而且髓核细胞培养条件要求比较高.免疫荧光检测细胞内同时有聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白存在,由此证明该细胞为髓核细胞.
结论:能通过酶序贯消化法提取纯净的髓核细胞并培养.
第二部分BMP9对人退变髓核细胞周期、增殖及细胞外基质的影响
目的:探讨BMP9对人退变髓核细胞周期、增殖及细胞外基质的影响.
方法:使用Ad-GFP和Ad-BMP9病毒感染P1代髓核细胞,BMP9为实验组,GFP作为对照组.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证BMP9表达成功;CCK-8检测BMP9对髓核细胞增殖的影响;流式细胞学检测BMP9对髓核细胞周期的影响.RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达量.
结果:经Ad-BMP9感染的髓核细胞内BMP9的表达量明显增多,而髓核细胞自身并不表达内源性BMP9.实验组内髓核细胞的增殖较对照组有统计学差异,且细胞G1期明显缩短,S期明显延长,G2-M期也有轻度延长.实验组内的聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达量均有明显增加,尤以聚蛋白多糖增加明显.
结论:BMP9能促进髓核细胞增殖,促进髓核细胞外基质表达.
第三部分BMP9与Notch信号通路的联系以及BMP9对髓核细胞内Notch信号的调控
目的:探讨BMP9与Notch信号通路的联系,了解髓核细胞内BMP9干预前后Notch信号受体和配体的变化.
方法:使用RT-PCR、Western blot检测BMP9干预后髓核细胞内Notch信号通路关键分子和靶基因的表达情况.随后通过RT-PCR检测BMP9干预后髓核细胞内Notch受体和配体的变化.
结果:BMP9干预后Notch信号通路的关键分子NICD-1(NICD活化形式之一)和靶基因hes1、hes5、hey2均减少,hey1、L无明显差异.未处理的髓核细胞内Notch信号的配体中以Jagged1表达最高, Jagged2、DLL3未表达.各受体均有不同程度表达,以Notch3表达最多.经BMP9干预后的髓核细胞内Notch1和DLL1减少,Notch4轻度上调,其余受体和配体未见明显变化.
结论:BMP9与Notch信号有紧密联系.
第四部分dnNotch1、DLL1、Jagged1对人退变髓核细胞外基质的调控
目的:探讨dnNotch1、DLL1、Jagged1对髓核细胞外基质的影响
方法:将dnNotch1、Jagged1、DLL1按如下分组①Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-BMP9+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-dnNotch1、Ad-BMP9+Ad-dnNotch1;②Ad-GFP+Ad-RFP 、 Ad-BMP9+Ad-RFP 、 Ad-GFP+Ad-Jagged1 、Ad-BMP9+Ad-Jagged1;③Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-BMP9+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1.各组分别干预髓核细胞,使用RT-PCR、Western blot检测聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达量,并进行组内对比.
结果:DLL1 组: 聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的 mRNA 表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1(P<0.05).Ad-GFP+Ad-DLL1和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1(P<0.05),Ad-GFP+Ad-DLL1和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).聚蛋白多糖:Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-DLL1(P<0.05),Ad-GFP+Ad-RFP和Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05).Ⅱ型胶原:Ad-GFP+Ad-RFP、Ad-GFP+Ad-DLL1、Ad-BMP9+Ad-DLL1之间无统计学差异(P>0.05);
Jagged1 组 : 聚 蛋 白 多 糖 、 Ⅱ型 胶 原 的 mRNA 表 达 :Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-Jagged1、Ad-BMP9+Ad-Jagged1(P<0.05). Ad-GFP+Ad-Jagged1 和 Ad-BMP9+Ad-Jagged1无 统 计 学 差 异 (P > 0.05) . 聚 蛋 白 多 糖 的 蛋 白 表 达 :Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-Jagged1(P < 0.05). Ad-BMP9+Ad-Jagged1和Ad-GFP+Ad-RFP、 Ad-GFP+Ad-Jagged1和Ad-BMP9+Ad-Jagged1无统计学差异(P>0.05)
Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP>Ad-BMP9+Ad-Jagged1>Ad-GFP+Ad-Jagged1.
dnNotch1 组: 聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1>Ad-GFP+Ad-dnNotch1>Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP有统计学差异(P<0.05)(图 4-11).聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原的蛋白表达:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1、Ad-GFP+Ad-dnNotch1>Ad-BMP9+Ad-RFP>Ad-GFP+Ad-RFP(P<0.05).聚蛋白多糖:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1>Ad-GFP+Ad-dnNotch1 有统计学差异(P<0.05).Ⅱ型胶原:Ad-BMP9+Ad-dnNotch1 和Ad-GFP+Ad-dnNotch1 无统计学差异(P>0.05).
结论:dnNotch1能显著促进髓核细胞表达聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原,而DLL1和Jagged1相反起抑制作用.