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目的:观察南瓜蛋白(Cucurmosin,Cus)对人肝癌Hep-G2细胞的体外增殖抑制和诱导凋亡作用;用NOD-SCID小鼠建立人肝癌Hep G2细胞的肝原位移植瘤模型,评价Cus在体抗肝癌的有效性;并初步探讨其诱导凋亡作用的可能机制,为南瓜蛋白的抗肝癌机制提供理论基础。方法:1 MTT法测定Cus (以TCS为对照)对体外培养人肝癌Hep G2细胞和人胚肝L-02细胞增殖的影响,评价其对人肝癌细胞作用选择性;2利用NOD/SCID小鼠建立人肝癌原位移植模型,体内观察南瓜蛋白对人肝癌小鼠原位移植瘤的抑瘤率。3电子显微镜观察南瓜蛋白作用后PANC-1细胞超微结构的改变。4流式细胞仪检测南瓜蛋白对Hep G2细胞细胞周期和凋亡发生率的影响。5 Annexin V/PI双染流式细胞术检测Hep G2细胞凋亡6 DNA断裂琼脂糖凝胶电泳观察是否有凋亡片段7 ELISA检测南瓜蛋白作用后Hep G2细胞的caspase-3和caspase-9活性的变化。8 western blot法检测南瓜蛋白作用后caspase-3、bcl-2、bax蛋白表达的变化。结果: MTT比色法结果显示, Cus对正常人胚肝(L-02)细胞的毒性作用(IC50为20.85μg/ml)远小于对人肝癌(HepG2)细胞的毒性(IC50为4.96μg/ml),Cus对人肝癌Hep G2细胞的具有一定的选择性。电子显微镜下见对照组细胞形态正常,细胞膜结构完整,常染色质丰富,可见多个核仁。治疗组而细胞密度增高,染色质凝集固宿,染色质边集,核固宿,核碎裂及凋亡小体的形成等细胞凋亡的表现;流式细胞仪DNA倍体分析检出典型的亚二倍体(sub-G1)凋亡峰,并且10 ug /mlCucurmosin分别作用24、48、72h,凋亡率分别为11.88%、23.47%、36.24%,呈明显的时间依赖性。Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果显示Cucurmosin作用的剂量依赖性,随着作用浓度的升高细胞凋亡率也随之增加。DNA断裂琼脂糖凝胶电泳分析出现“阶梯状”DNA条带,呈约180-220bp整数倍递增分布,提示DNA在核小体部位被切断,细胞发生凋亡。所有上述结果充分说明,Cucurmosin具有诱导Hep-G2细胞凋亡的作用。在动物体内,人肝癌HepG2细胞/NOD-SCID小鼠原位移植瘤模型治疗实验结果显示:Cus对人肝癌移植瘤生长具有显著抑制作用,1、0.5、0.25mg/kg的Cus对人肝癌原位移植瘤的瘤重抑制率分别为71.11%,64.85%和51.19%。Western blot分析结果表明:经2.5、5、10、20、40μg/ml的Cus处理72h后, Bcl-2蛋白表达下调、Bax表达上调,Caspase 3的活性片段被不同程度的激活,呈浓度依赖性;用Caspase 3、Caspase-9活性检测试剂盒测定,结果显示:Caspase 3、Caspase-9均被激活,并且呈浓度依赖性。结论:1、Cus对人肝癌Hep-G2细胞具有很强的增殖抑制作用(IC50为4.96ug/ml),比TCS对该肿瘤细胞的作用(IC50约20.15 ug /ml)强4倍多,并且对人胚肝细胞系L-02细胞毒性(IC50约为20.85ug/ml)小,其细胞毒作用具有相对选择性。2、Cus能有效诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。3、Cus对人肝癌HepG2细胞小鼠原位移植瘤具有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性。4、Cus诱导HepG2细胞凋亡作用可能与其上调Bax,下调Bcl-2蛋白表达水平,然后激活caspase-9,并最终激活下游caspase-3有关。