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[目的]研究耐药肺癌—宣威肺癌细胞的耐药特点,探讨Brusatol与NCT503对宣威肺癌细胞的协同抑制作用及其具体机制,为宣威肺癌的临床治疗提供新的实验依据。[方法]1.宣威肺癌耐药性检测:使用CCK8法检测化疗药物顺铂处理4种肺腺癌细胞系 PC-9、A549、XLA-07 和 XL-jt 24h 和 3 种靶点药物 AG1478（EGFR 抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）、U0126（MEK1/2抑制剂）处理72h后的吸光度,并计算细胞生存率和半数抑制浓度（IC50）。2.Brusatol对肺癌细胞的抑制作用:CCK8法检测Brusatol处理4种肺腺癌细胞系PC-9、A549、XLA-07和XL-jt72h后的吸光度,计算细胞的半数抑制浓度（IC50）;使用活性氧检测试剂盒检测Brusatol处理12h后的ROS水平;使用EdU-555细胞增殖检测试剂盒检测Brusatol处理72h后的增殖抑制情况。3.Brusatol对Nrf2、HMOX1和NQO1蛋白的抑制作用:检测4种细胞Nrf2、HMOX1和NQO1蛋白的表达差异;使用不同浓度的Brusatol处理4株细胞系8h后检测核蛋白Nrf2的表达水平,以及Brusatol处理24小时后检测HMOX1和NQO1的总蛋白表达水平。4.Brusatol诱导宣威肺癌细胞系丝氨酸合成通路和叶酸循环代谢酶上调:使用不同浓度的Brusatol处理4株细胞系24h后提取总蛋白,检测丝氨酸合成通路和叶酸循环代谢酶的表达情况。5.NCT503和Pemetrexed对肺癌细胞的作用:CCK8法检测NCT503和Pemetrexed处理4种肺腺癌细胞系PC-9,A549,XLA-07和XL-jt72h后的吸光度,并计算细胞的半数抑制浓度（IC50）;使用活性氧检测试剂盒检测NCT503和Pemetrexed处理12h后的ROS水平;使用EdU-555细胞增殖检测试剂盒检测NCT503和Pemetrexed处理72h后的细胞增殖抑制情况。6.Brusatol 与 NCT503、Brusatol 与 Pemetrexed 的联合作用:使用 CCK8 法检测单纯给药组和联合给药组72h后的吸光度,计算抑制率,再根据金式公式判断联合作用形式。7.顺铂、NCT503、Pemetrexed、Brusatol、Brusatol 与 NCT503 联合使用以及Brusatol与Pemetrexed联合使用处理4株细胞系24h后提取总蛋白,检测丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达以及NCT503、Pemetrexed、Brusatol、Brusatol与NCT503和Brusatol与Pemetrexed处理4株细胞系后γ-H2AX的表达水平。8.NADPH检测:使用NADP+/NADPH检测试剂盒,检测Brusatol;Brusatol+NCT503、Brusatol+Pemetrexed 处理 24h 后 NADP+/NADPH 水平。9.Brusatol与NCT503肿瘤抑制的回复实验:Brusatol与NCT503联合处理4个细胞系并回补NADPH、NAC和GSH 72h后,检测吸光度,制作细胞活力曲线图。[结果]1.宣威肺癌细胞株XLA-07和XL-jt对顺铂、EGFR抑制剂AG1478和MEK抑制剂U0126的耐药性强于PC-9和A549。2.Brusatol能在极低浓度20nmol/L情况下,显著抑制PC-9,A549,XLA-07和XL-jt4种细胞的生存率,与PC-9和A549相比,宣威肺癌细胞株XLA-07和XL-jt对 Brusatol表现出更强的耐药性。4nmol/LBrusatol处理 PC-9,A549,XLA-07和XL-jt细胞后显著提高肺癌细胞内的ROS水平和抑制肺癌细胞的增殖。3.PC-9和A549细胞内Nrf2、HMOX1和NQO1蛋白的表达高于XLA-07和XL-jt细胞;Brusatol处理4株细胞系8h后抑制了核蛋白Nrf2的表达,以及Brusatol处理24h后抑制HMOX1、NQO1的总蛋白表达。4.Brusatol处理4株细胞24h后,仅宣威肺癌细胞XLA-07和XL-jt成功诱导丝氨酸合成酶PHGDP、PSAT1、PSPH和叶酸循环代谢酶SHMTs和MTHFDs的表达。5.XLA-07和XL-jt对NCT503的敏感度大致相同,相较于PC-9和A549更加耐受NCT503。XLA-07（IC50 74.41μmol/L）和 XL-jt（IC50 68.53μmol/L）对Pemetrexed的耐受度是普通肺腺癌细胞PC-9（IC500.41μmol/L）和A549（IC500.57μmol/L）的 1 00 倍。10μmol/LNCT503 和 10μmol/LPemetrexed 处理 PC-9,A549,XLA-07和XL-jt细胞12h后可导致细胞内ROS上升。10μmol/LNCT503处理PC-9,A549,XLA-07 和 XL-jt 细胞 72h 以及 10μmol/LPemetrexed 处理 XLA-07 和 XL-jt、0.1 μmol/LPemetrexed处理PC-9和A549细胞72h后可明显抑制肺癌细胞的增殖。6.根据金式公式计算联合作用的形式,Brusatol与NCT503联用在4株细胞均呈现协同作用;Brusatol与Pemetrexed联用在PC-9表现出协同作用、在A549则表现出协同和相加作用、在XLA-07表现出相加作用以及在XL-jt表现出协同和拮抗作用。7.Brusatol 与 NCT503 和 Brusatol 与 Pemetrexed 联合使用抑制了 Brusatol 诱导的宣威肺癌细胞丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达上调,而顺铂未诱导宣威肺癌细胞丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达上调。Brusatol与NCT503和Brusatol与Pemetrexed联合处理宣威肺癌细胞DNA损伤水平高于NCT503、Pemetrexed、Brusatol 单独处理。而 Brusatol 与 NCT503 和Brusatol 与Pemetrexed 联合处理 PC-9,A549 细胞 DNA 损伤水平低于 NCT503、Pemetrexed、Brusatol单独处理。8.Brusatol联合NCT503或Pemetrexate处理结果与Brusatol单独处理相比,可进一步降低4株细胞系内NADPH水平,其中Brusatol联合NCT503处理4株细胞系后的NADPH水平最低。9.Brusatol与NCT503肿瘤抑制的回复实验表明:分别用NADPH、NAC、GSH补偿Brusatol联合NCT503抑制肺癌细胞增殖作用,NADPH补偿后4个细胞系的存活率升高。[结论]1.耐药结果显示宣威肺癌对化疗药物普遍耐药的特点和不良预后。2.Brusatol可显著抑制PC-9,、A549、XLA-07和XL-jt 4株细胞,抑制肺癌细胞的增殖和提高肺癌细胞内ROS水平,说明Brusatol可能成为治疗宣威肺癌潜在的靶向药物。但是宣威肺癌细胞株XLA-07和XL-jt对Brusatol也表现出更强的耐药性。3.PC-9和A549细胞内Nrf2、HMOX1和NQO1蛋白的表达高于XLA-07和XL-jt细胞;解释了 PC-9,A549对Brusatol更易感的原因。Brusatol抑制了宣威肺癌核蛋白内Nrf2以及HMOX1、NQO1的蛋白表达。4.Brusatol处理后,仅宣威肺癌细胞XLA-07和XL-jt成功诱导丝氨酸合成酶PHGDP、PSAT1、PSPH和叶酸循环代谢酶SHMTs和MTHFDs的表达,使其适应Nrf2抑制带来的氧化应激。说明仅在宣威肺癌细胞中丝氨酸合成通路和叶酸循环代谢通路上调以补偿Nrf2抑制。5.XLA-07 和 XL-jt 相较于 PC-9 和 A549 更加耐受 NCT503。XLA-07 和 XL-jt对Pemetrexed的耐受程度是普通肺腺癌细胞PC-9和A549的100倍。NCT503和Pemetrexed均能诱导肺癌细胞ROS上升和抑制肺癌细胞的增殖。6.Brusatol与NCT503在4株细胞均是协同作用;Brusatol与Pemetrexed联用在PC-9上表现出协同作用、在A549上表现出协同和相加作用、在XLA-07上表现出相加作用以及在XL-jt上表现出协同和拮抗作用。7.Brusatol诱导的宣威肺癌细胞丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达上调是Nrf2抑制特异性的。Brusatol与NCT503联合使用抑制了 Brusatol诱导的宣威肺癌细胞丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达上调,从而更好地抑制宣威肺癌细胞增殖。Brusatol与Pemetrexed联合染毒,虽然Brusatol诱导的叶酸循环代谢通路被抑制,但是丝氨酸合成通路补偿性地上调,解释了 Brusatol与NCT503联合处理组的抑制效果好于Brusatol与Pemetrexed联合处理组的原因。Brusatol联合NCT503或Pemetrexed诱导宣威肺癌细胞的γ-H2AX水平高于Brusatol处理组,Brusatol与Pemetrexed联用通过诱导宣威肺癌细胞系更显著的DNA损伤以抑制宣威肺癌细胞增殖。而Brusatol未诱导PC-9和A549细胞丝氨酸合成途径和叶酸循环代谢酶的表达上调,因此Brusatol与NCT503联用;Brusatol与Pemetrexed联用未诱导PC-9和A549细胞系有更显著的DNA损伤。8.Brusatol联合NCT503相比较于Brusatol与Pemetrexed联用处理细胞会更进一步降低4株细胞系内的NADPH水平,特别是PC-9和A549细胞。Brusatol联合NCT503通过降低NADPH水平显著抑制肺癌细胞增殖。9.Brusatol联合NCT503处理后,NADPH是主要的维持氧化还原平衡以维持肺癌细胞生存的关键代谢物。