【摘 要】
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研究目的:（1）采用电喷雾方法探索制备基于海藻酸盐-明胶-脂肪间充质干细胞的组织工程微组织并评价其用于软骨组织工程的可行性。（2）探究此种微组织修复SD大鼠关节软骨损伤的有效性。研究方法:（1）采用三系（成骨、成软骨、成脂肪）诱导分化、流式细胞术和倒置显微镜形态学观察对所分离的脂肪间充质干细胞（ADSCs）进行细胞学表征;电喷雾法制备含有不同明胶浓度的改良藻酸盐微球,形成藻酸盐-明胶（Alg-Ge
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81972047）； 国家重点研发计划（2016YFC1102104）；
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研究目的:（1）采用电喷雾方法探索制备基于海藻酸盐-明胶-脂肪间充质干细胞的组织工程微组织并评价其用于软骨组织工程的可行性。（2）探究此种微组织修复SD大鼠关节软骨损伤的有效性。研究方法:（1）采用三系（成骨、成软骨、成脂肪）诱导分化、流式细胞术和倒置显微镜形态学观察对所分离的脂肪间充质干细胞（ADSCs）进行细胞学表征;电喷雾法制备含有不同明胶浓度的改良藻酸盐微球,形成藻酸盐-明胶（Alg-Gel）微球,通过测算微球直径并行统计学分析对成球情况进行评价,找到能够形成完整的Alg-Gel微球的溶液浓度和配比;根据合适的溶质浓度制备基于藻酸盐-明胶-脂肪干细胞的球形微组织（Microtissue-Spheres,MSs）和基于藻酸盐-脂肪干细胞的球形微组织。通过活死染色、细胞增殖计数比较藻酸盐-明胶-脂肪干细胞球形微组织（Alg-Gel-ADSCs MSs）和藻酸盐-脂肪干细胞球形微组织（Alg-ADSCs MSs）对ADSCs的活性和生长增殖的支持能力;通过激光共聚焦显微镜观察两种MSs中不同培养时间点的活性细胞形态;采用软骨诱导培养并行阿尔新蓝染色和糖胺聚糖（GAG）含量分析的方法比较Alg-Gel-ADSCs MSs和Alg-ADSCs MSs软骨基质成分的分泌情况,总体评估其在软骨组织工程中的可行性。（2）将Alg-Gel-ADSCs MSs植入SD大鼠的软骨缺损部位,通过小动物活体荧光成像仪追踪评价ADSCs是否可驻留与关节软骨缺损部位;并在不同时间点评估软骨修复效果。评估内容包括:大体观察及系统评分定量分析;组织学评估包括HE染色、天狼星红染色、免疫组织化学评估;微型计算机断层扫描（micro-CT）软骨下骨的修复情况以及小动物步态分析的定量及定性评估。研究结果:（1）我们分离出的ADSCs具有多向分化能力,可用于软骨组织工程;溶质为1.5%藻酸钠或1.5%藻酸钠+0.5%明胶能够通过电喷雾法制备出完整的微球,微球直径为365.85±16.88或358.85±23.97μm,无统计学差异（P＜0.05）;通过相同电喷雾参数以及合适的溶质浓度配比构建Alg-Gel-ADSCs MSs、Alg-ADSCs MSs、藻酸盐-明胶微球、藻酸盐微球的直径为358.59±30.44μm,各组之间无显著差异（P＞0.05）。体外旋转生物反应器14天培养,与Alg-ADSCs MSs相比,Alg-Gel-ADSCs MSs中的ADSCs的数目更多（7.73±0.47×10~6 VS 15.7±0.95×10~6,P＜0.05）,细胞存活率更高（75.4±0.58%VS 93.73±1.75%,P＜0.05）。共聚焦显微镜观察到MSs中的细胞由于被水凝胶包裹而伪足伸展不明显。经21天成软骨诱导,与Alg-ADSCs MSs相比,Alg-Gel-ADSCs MSs中的糖胺多糖含量更高（10.15±0.43μg/ml VS 19.54±1.28μg/ml,P＜0.05）。（2）在修复SD大鼠膝关节软骨缺损的体内实验中,Alg-Gel-ADSCs MSs在细胞示踪,组织学评估,Micro-CT图像和步态分析方面显示出更为优异的软骨修复能力。具体来说,Alg-Gel-ADSCs MSs可使ADSCs在软骨缺损部位驻留至少3周;采用Alg-Gel-ADSCs MSs修复SD大鼠软骨缺损12周后,从大体观及其评分、HE染色上来看,Alg-Gel-ADSCs MSs所修复的软骨缺损位置比对照组更平整光滑（差异具有统计学意义）,软骨表面含有细胞层,且胶原成分较多。从免疫组化和天狼星红染色的结果上来看,Alg-Gel-ADSCs MSs所修复的软骨表面中二型胶原成分及排列更类似于天然软骨。从Micro-CT和步态分析的结果上来看,Alg-Gel-ADSCs MSs组对软骨下骨的修复作用及对膝关节功能恢复作用均优于对照组（差异具有统计学意义）。研究结论:（1）相比较于Alg-ADSCs MSs,Alg-Gel-ADSCs MSs中ADSCs的活性更强,并且更好地促进其增殖和软骨基质成分的沉积。（2）Alg-Gel-ADSCs MSs作为功能性组织工程微组织在软骨组织修复中显示出优越的修复功效和应用前景。
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