【摘 要】
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偶氮染料是工业合成染料中用途最广且用量最大的一类,具有结构稳定、强毒性、强稳定性及难降解等特点,给人体健康和环境治理带来巨大的风险与挑战,因此偶氮染料的脱色与解毒是工业染料废水处理的首要任务。CotA漆酶是一种能催化染料脱色降解的高鲁棒性耐热耐碱酶,作为一种绿色友好的生物催化剂,在染料脱色方面表现出极大的应用潜力。CotA漆酶催化偶氮染料的脱色降解通常需要介体的辅助,而介体自身的毒性及高成本等不利
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偶氮染料是工业合成染料中用途最广且用量最大的一类,具有结构稳定、强毒性、强稳定性及难降解等特点,给人体健康和环境治理带来巨大的风险与挑战,因此偶氮染料的脱色与解毒是工业染料废水处理的首要任务。CotA漆酶是一种能催化染料脱色降解的高鲁棒性耐热耐碱酶,作为一种绿色友好的生物催化剂,在染料脱色方面表现出极大的应用潜力。CotA漆酶催化偶氮染料的脱色降解通常需要介体的辅助,而介体自身的毒性及高成本等不利因素大大限制了介体的实际应用。本研究以典型偶氮染料刚果红（Congo Red）为模型化合物,将CotA漆酶与底物刚果红进行分子对接,通过理性分析CotA漆酶/刚果红的复合物结构,利用定点饱和突变方法对短小芽孢杆菌W3（Bacillus pumilus W3）CotA漆酶进行分子改造,尝试提高无介体添加条件下其对刚果红的脱色活力,并研究分析CotA漆酶对刚果红的降解途径及机理,为染料废水的生物脱色处理提供新的酶工具。论文主要研究结果如下:（1）采用同源建模和分子对接方法获得了B.pumilus W3 CotA漆酶/刚果红复合物结构,分析两者相互作用模式,理性选择了可能影响CotA漆酶作用刚果红的三个残基作为候选改造位点,即底物结合口袋两端的Gly323、Thr377以及T1 Cu附近的Thr418;（2）成功构建CotA漆酶三个靶残基的单点饱和突变文库,筛选获得了单点有益突变体G323S、T377I和T418G。进一步构建了组合突变体,最终获得两个脱色活力显著提高的突变体T377I/T418G和G323S/T377I/T418G,该两个组合突变体在p H 8.0,无介体添加下催化反应24 h,对刚果红的脱色率分别可达到51.77%和41.34%,相对野生CotA漆酶分别提高了3.01倍和2.40倍;（3）反应动力学参数分析表明,突变体T377I/T418G和G323S/T377I/T418G对刚果红的催化效率(kcat/Km)相对野生酶分别提高了2.21倍和2.01倍,且酶学性质分析表明两个突变体仍然保留了野生酶优良的热稳定性及碱耐受性。利用分子对接分析了两个突变体催化活力提高的结构机理;（4）通过对最优脱色突变体T377I/T418G作用刚果红的脱色特性研究确立了较佳脱色条件:染料浓度25 mg?L-1,p H 7.0,温度60℃,在该条件下T377I/T418G对刚果红的催化效率达到3.96 L·mmol-1·s-1,是野生型的2.21倍,8 h后脱色率可达86.47%;（5）利用紫外可见吸收光谱（UV/VIS）、气质联用（GC-MS）、液质联用（LC-MS）技术研究了最优突变体T377I/T418G催化刚果红的脱色降解机制。研究结果显示刚果红在T377I/T418G作用下先发生偶氮键的不对称性断裂,随后碳氮键断开,取代基随之发生氧化产生萘磺酸钠、联苯二酚和一种氢过氧化物,这些物质在环境及漆酶的共同作用下进一步被降解成其他小分子化合物。
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