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禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。AI是造成全球突发卫生事件最常见的传染病。自1878年意大利鸡群首次爆发该病以来,世界各地都相继有各种亚型的AI爆发。尤其是高致病性禽流感(HighPathogenic Avian Influenza,HPAI)可导致高达100％发病率和/或死亡率。自2003年以来,H5N1亚型高致病性禽流感病毒已在全球范围内流行,不仅导致禽类的大量死亡,而且可以直接感染人引起人的死亡。据世界卫生组织(WHO)统计,截止到2007年4月11日,全球人禽流感感染病例291起,其中死亡172起。我国共发生人感染禽流感病例24起,其中15例死亡。高致病性禽流感已经成为制约全球经济发展和威胁人类和动物健康的重大传染病,引起了各国政府和学者的高度关注。
A型流感病毒亚型众多,易变。血凝素基因(Hemagglutinin,HA)是禽流感病毒的主要的保护性抗原,能刺激机体产生良好的免疫应答而免受感染,也是AIV中最容易发生突变的基因,虽然目前对。HA基因做了大量的研究,但是对于其抗原表位的突变方式仍然知之甚少,因此也无法提前制备疫苗来预防和控制禽流感的爆发。基于高致病性禽流感流行情况,本试验开展了抗高致病性禽流感H5N1的卵黄抗体的被动免疫效果以及禽流感H5N1病毒HA抗原的单抗逃逸突变株的基因序列分析。主要研究内容和结果如下:
1.禽流感卵黄抗体的研究
本试验用禽流感灭活疫苗(H5N1,Re-1株)免疫20周龄的高产来航蛋鸡,制备抗禽流感病毒H5N1高免卵黄抗体(IgY)。在比较了三种缓冲液对IgY活性的影响后,确定采用水稀释法提取IgY。同时在模拟的胃肠内环境下对IgY的各种理化性质进行了试验,结果表明纯化的IgY在pH2.0,胃蛋白酶终浓度为1.5 mg/mL以及在pH18.0、胰蛋白酶终浓度为2.5 mg/mL的环境下,37℃作用1 h后ELISA抗体效价均无明显下降；同时,热稳定性试验表明,IgY在60℃作用30min,ELISA抗体效价也无明显下降；通过中和试验测得IgY的中和效价为1:640；用鸡进行攻毒保护试验以验证所制备的卵黄抗体的被动免疫效果,结果表明,注射IgY能有效的抵抗10LD50 HPAIV H5N1攻击,其保护率达到100％。口服卵黄抗体能起到一定的保护效果,在第一次攻毒后各个稀释预防组均能达到75％的保护率,1:4倍稀释的治疗组也达到了50％的保护率。以上试验结果显示,所制备的高免卵黄抗体(IgY)在理化性质、攻毒保护试验以及在MDCK细胞上的中和H5N1亚型AIV的能力等方面都显示了很好的特性,在紧急预防和治疗人感染禽流感中有很好的应用潜能。
2.禽流感HA单抗逃逸突变株的筛选与分析
本研究利用单克降抗体逃逸突变的方法,获得本室分离株A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)毒株与本室制备的H5N1 HA的单抗2C9、2E11、5E12和1C4的逃逸突变株。确认为单抗突变毒株之后,扩增HA基因,用DNAclub分析HA碱基序列以及氨基酸序列的变化,以期能够找到单抗所识别的HA的中和位点。测序结果发现,2C9MUT的HA序列在第383、463、610、675和766位碱基分别发生了A-G、A-G、A-G、T-G和G-A的突变；2E11MUT的HA序列在第187、463、524、675和766位碱基分别发生了G-A、A-G、C-A、T-G和G-A的突变；5E12MUT的HA序列在第463、629、675和766位碱基发生了A-G、C-T、T-G和G-A的突变,1C4MUT的HA序列在第463、629、675和766位碱基发生了A-G、C-T、T-G和G-A的突变。2C9 MUT第128、155、204、225和256位氨基酸序列分别发生了His-Gly、Arg-Gly、Thr-Ala、Phe-Leu和Asp-Asn的突变；2E11MUT第63、155、175、225和256位氨基酸序列分别发生了Val-Met、Arg-Gly、Thr-Lys、Phe-Leu、Asp-Asn的突变；5E12MUT第155、225和256位氨基酸序列和分别发生了Arg-Gly、Phe-Leu和Asp-Asn的突变,IC4MUT第155、225和256氨基酸序列和分别发生了Arg-Gly、Phe-Leu和Asp-Asn的突变。结果表明,在HA的155、225和256位氨基酸是HA抗原表位中的关键位点,也是抗体结合的关键区域。这些位点均位于HA的球状头部HA1部分,HA抗原表面主要的抗原决定族位于HA1区域。以上结果为H5N1禽流感HA抗原表位的鉴定提供了重要的依据,为新型表位疫苗的设计和使用提供了理论支持。