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第一章FK228对预致敏皮肤移植小鼠供者特异性抗体产生的影响及机制研究目的:探究同种异体小鼠预致敏皮肤移植模型中HDACs和乙酰化组蛋白表达情况,以及HDACI-FK228在供者特异性抗体产生过程中的作用及其机制。方法:采用同种异体小鼠尾部-背部异位皮肤移植法建立模型。在-14天进行从BALB/C到C57BL/6小鼠的第一次预致敏皮肤移植手术。在第0天对同一受体小鼠进行二次皮肤移植。将受体小鼠分为三组:C57BL/6--C57BL/6同基因组、BALB/c--C57BL/6异基因组、BALB/c--C57BL/6+FK228处理组,FK228以0.5 mg/kg/d的剂量腹膜内注射,从第0天起给药,每组n=12。手术后每天监测皮肤移植物的存活情况,记录受体小鼠移植皮肤的存活时间。将移植皮肤物坏死面积＞90%定义为皮肤移植物完全排斥。于第0天、7天、14天获取受体小鼠外周血标本（n=6）,采用流式细胞术-抗体结合试验检测小鼠外周循环中供体特异性抗体DSA-IgG、IgM水平。另外在第10天收集各组受体小鼠外周血、脾脏和移植皮肤标本（n=6）,对移植皮肤组织进行HE染色,评估其病理变化。通过ELISA技术检测血清中细胞因子水平;流式细胞技术检测脾脏组织CD4+PD-1+CXCR5+Tfh、B220lowCD138+浆细胞的比例。提取脾脏总RNA,采用RT-PCR技术检测B细胞相关Pax5、Bcl-6、Bach2的mRNA水平,浆细胞生成相关Blimp-1、Irf4、Xbp1的mRNA水平,以及Hdac1和Hdac2转录水平。提取脾脏总蛋白,利用Western blot技术检测HDAC1、HDAC2和组蛋白H2A、H3乙酰化的水平,抗体合成修饰相关的内质网应激UPR中IRE1α-XBP1通路蛋白表达水平以及抗体分泌相关的BLIMP-1及CSR相关的AID表达水平。结果:异基因组中第一次和第二次同种异体皮肤移植后移植物的中位存活时间分别为12天和11天。在第二次同种异体皮肤移植后,由于FK228的使用,皮肤移植物的存活时间明显延长（MST=25天,P＜0.0001）。移植第10天皮肤组织HE染色结果显示,与同基因组相比,异基因组和FK228组小鼠移植皮肤的表皮损伤明显、无角化,毛囊破坏,单核细胞浸润严重;与异基因组相比,FK228组小鼠皮肤表皮损伤稍轻,单核细胞浸润减轻。流式检测结果显示二次皮肤移植术当天,各组小鼠循环中DSA-IgG、IgM阳性,说明预致敏成功。在二次移植后,与同基因组小鼠相比,异基因组和FK228组小鼠DSA-IgM、IgG水平升高。同基因组与FK228组在第7、14天的DSA-IgM、IgG水平也均低于异基因组（P＜0.01）。与异基因组相比,FK228组CD4+PD-1+CXCR5+Tfh、B220lowCD138+浆细胞比例显著降低（P＜0.05）。ELISA结果显示FK228组中小鼠体内IL-21的水平显著低于异基因组（P＜0.05）。RT-PCR结果表明,与同基因组相比,在异基因组中Hdac1和Hdac2高水平转录（P＜0.05）;然而与异基因组相比,FK228组中Hdac1和Hdac2转录水平显著降低（P＜0.05）。异基因组和FK228组在脾脏中的B细胞相关的关键转录因子Pax5、Bcl-6、Bach2转录水平无明显差异（P＞0.05）。FK228明显下调了浆细胞生成相关Prdm-1、Xbp1mRNA转录水平（P＜0.05）,然而Irf4无显著差异（P＞0.05）。Western blot结果显示,与同基因组相比,异基因组脾脏中HDAC1和HDAC2蛋白表达升高,同时AID、BLIMP-1、p-IRE1α,XBP1水平也出现升高（P＜0.05）;与异基因组相比,FK228组脾脏中HDAC1和HDAC2表达被抑制,乙酰化组蛋白H2A和H3水平明显升高（P＜0.05）,同时AID、BLIMP-1、p-IRE1α,XBP1水平明显下降（P＜0.05）。结论:FK228显著改善了预致敏后皮肤移植小鼠的移植物存活,降低了体内DSA的水平。FK228可能通过下调Pridm-1、Xbp1的转录,进而抑制浆细胞生成,降低了浆细胞比例。此外,FK228下调了Tfh比例以及IL-21水平。在内质网应激UPR中,FK228可能通过抑制HDAC1和HDAC2的表达,抑制抗体的合成修饰相关的IRE1α-XBP1通路活性。此外FK228还通过抑制抗体的分泌相关BLIMP-1的表达,以及下调抗体类别转换进程关键因子AID的水平。第二章FK228体外抑制B细胞及机制研究目的:探究体外B细胞培养过程与HDAC的表达之间关系,以及I类HDACI-FK228在体外抗体产生中发挥的作用和机制。方法:通过磁珠分选从C57BL/6小鼠的脾脏中提取原代CD19+B细胞,用1 ug/ml anti-CD40抗体和10 ng/ml IL-4刺激原代B细胞。分control、FK228组（不同药物浓度梯度）。细胞培养2天,通过CCK8和Annexin V-PI评估FK228对B细胞增殖和凋亡的影响。培养6天后,利用ELISA检测上清中IgG1、IgM。收集各组细胞沉淀,提取RNA和蛋白质,采用RT-PCR技术检测浆细胞相关Prdm-1、Irf4、Xbp1的mRNA水平。采用流式细胞技术检测B220lowCD138+浆细胞的比例以及CD80、MHCⅡ的表达。利用Western blot技术检测B细胞中HDAC1、HDAC2、乙酰化组蛋白H2A、H3水平,以及FK228在体外对IRE1α的磷酸化、XBP1、BLIMP-1和AID表达水平。结果:当药物浓度达到5、8n M时,FK228对B细胞增殖和凋亡的影响具有显著差异。B细胞培养6天,收集培养上清液,ELISA检测显示,与control组相比,FK228显著降低了IgM和IgG1的水平（P＜0.05）。Western blot显示,FK228在体外也抑制HDAC1和HDAC2的表达,上调乙酰化组蛋白H2A和H3。在RNA水平上,FK228显著抑制Prdm-1、Xbp1表达（P＜0.05）,对Irf4无显著影响。流式检测显示,FK228显著降低B220lowCD138+浆细胞比例,同时CD80、MHC-Ⅱ的表达量也随FK228使用而降低。在蛋白水平上,FK228显著降低AID、BLIMP-1、XBP1、p-IRE1α的表达（P＜0.05）。结论:FK228可抑制B细胞的增殖并促进其凋亡。FK228在体外抑制了B细胞分化以及IgG1和IgM的水平。FK228干预可抑制HDAC1和HDAC2的表达,促进组蛋白H2A和H3相应位点发生乙酰化,下调Pridm-1、Xbp1的转录水平,抑制B细胞向浆细胞分化。此外,FK228还干扰内质网应激UPR中IRE1α-XBP1通路活性,从而抑制抗体的合成修饰。同时FK228对BLIMP-1表达抑制可能干预抗体分泌,对AID表达的抑制也可能干扰CSR进程。最终这些因素共同作用降低抗体水平。