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目的:本文旨在探究绝经后女性雌激素受体表达降低、血管病变与DNA甲基化的相关性,并尝试验证地黄中单体有效成分梓醇（Catalpol）是否通过调节甲基供体的动态平衡来改善雌激素受体（Estrogen receptor,ER）的DNA异常高甲基化,从而上调雌激素受体表达以抑制动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）进程,并探索其中可能机制。方法:第一章:使用去卵巢LDLR-/-小鼠合并高脂饮食喂养,复制绝经后AS模型,给予雌二醇（Estradiol,E2）、梓醇治疗后,运用生化、油红、马松染色等方法观察梓醇对血脂水平、主动脉病理形态、主动脉平滑肌增殖等指标的影响;运用试剂盒、免疫组化观察血清及主动脉ERs表达和血清、主动脉中DNMTs（DNA methyltransferase,DNMT）表达以评估 ERs 与 DNMTs 的相关性;进而运用免疫组化、HPLC-MS观察SAHH表达、血液甲基化水平、肝脏组织甲基供体水平以评估梓醇对DNA甲基化的调节作用。第二章:利用100 nMAngⅡ复制人血管平滑肌细胞（HVSMC）增殖模型,并在细胞模型上运用MTT、划痕、Transwell、细胞周期、免疫荧光、蛋白印迹以及HPLC-MS等方法,观察梓醇对HVSMC增殖迁移能力及表型转化的影响,及其与ERs表达及DNA甲基化的相关性,探究梓醇能否通过下调ERs基因DNA甲基化水平,从而增加ERs蛋白表达,发挥抗绝经后AS的作用。第三章:为初步探究梓醇下调ESR1 DNA甲基化水平是否与SAHH相关,利用Ad-SAHH转染升高HVSMC中SAHH表达,同时复制HVSMC增殖模型,运用划痕实验、Transwell实验、细胞周期、免疫荧光、蛋白印迹以及HPLC-MS等方法,观察梓醇在SAHH高表达条件下对HVSMC增殖迁移能力、SAHH及ERα蛋白表达、DNA甲基化状态及甲基供体的影响。第四章:为进一步探究梓醇下调ESR1 DNA甲基化水平是否依赖于SAHH,使用si-SAHH转染敲低SAHH表达,并利用AngⅡ复制HVSMC增殖模型,运用划痕、Transwell、细胞周期、免疫荧光、蛋白印迹以及HPLC-MS等方法,观察梓醇在SAHH低表达条件下对HVSMC增殖迁移能力、SAHH及ERα蛋白表达、DNA甲基化状态及甲基供体的影响。第五章:为进一步研究ESR1 DNA甲基化状态与血管平滑肌增殖的相关性,同时观察梓醇干预的作用,使用Cas9-sgRNA技术构建定向DNA甲基化质粒并转染,使得ESR1特异性高甲基化,并运用划痕、Transwell、细胞周期、免疫荧光、蛋白印迹等方法,观察梓醇在ESR1高甲基化条件下对HVSMC增殖迁移能力及ERα蛋白表达的影响。结果:第一章:与空白组相比绝经后AS模型小鼠TC、LDL-C和TG水平显著升高,而HDL-C未见明显的下降,给予雌激素或梓醇干预可明显降低TC、LDL-C和TG水平。结合主动脉油红O,主动脉根部切片油红O及马松染色可观察到,C57小鼠给予高脂饮食90天无法诱导主动脉粥样硬化斑块的产生;LDLR-/-小鼠加喂高脂饲料则可见主动脉脂质沉积,AS斑块形成,平滑肌层合并内膜层增厚;在此基础上去卵巢小鼠不仅主动脉内外脂质沉积进一步增加,斑块形成也明显增多,证实卵巢切除加重了主动脉病变;而给予梓醇则能显著改善这些主动脉病变。对比于空白组小鼠,可以观察到模型组小鼠主动脉根部切片ERα、ERβ及GPR30表达的显著降低,DNMT1、DNMT3a及DNMT3b表达的显著升高以及血清中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b活性的显著升高,而给予梓醇治疗显著下调了模型组升高的DNMTs表达,逆转了 ERs表达的降低。对比于空白组小鼠,可以观察到模型组小鼠肝脏SAM/SAH 比值显著升高,而给予梓醇后明显升高了小鼠肝脏SAH水平,而SAM水平未见明显下降,从而逆转了模型组SAM/SAH 比值的升高。第二章:结果显示100 nMAngⅡ可促使HVSMC的增殖迁移能力明显升高,G0/G1期细胞比例显著降低,S期合并G2/M期细胞比例明显增加,OPN荧光强度显著升高,α-SMA荧光强度显著降低,表明AngⅡ诱导促使HVSMC进入S及G2/M期,并使其从收缩表型向增殖表型转换。而给予E2及梓醇干预后可显著逆转其异常增殖,增加了 G0/G1期细胞比例,有效地将HVSMC阻滞在G0/G1期,抑制了收缩表型向增殖表型的转换。HVSMC增殖模型ERa、ERβ、GPR30 表达明显下调,DNMT1、DNMT3α、DNMT3b 及 SAHH 表达明显升高;5-mC、SAM水平及SAM/SAH 比值显著升高,5-hmC及SAH水平下降。在给予E2及梓醇后有效降低了 DNMTs表达,并使ERα表达增加;E2还可增加ERβ及GPR30的表达,而梓醇上调ERβ及GPR30表达的作用并不明显;E2以及梓醇还可抑制SAHH表达,降低5-mC、SAM水平及SAM/SAH 比值,升高5-hmC及SAH水平。AngⅡ诱导HVSMC增殖后,ESR1基因的DNA甲基化率显著上升,多个CpG岛片段的甲基化率均显著升高;在给予E2以及梓醇进行干预后,各片段及ESR1基因的甲基化率均明显降低。第三章:结果显示转染Ad-SAHH将SAHH过表达可促使HVSMC的增殖迁移能力明显升高,G0/G1期细胞比例显著降低,S期合并G2/M期细胞比例明显增加,OPN荧光强度显著升高,α-SMA荧光强度显著降低;给予梓醇抑制HVSMC增殖迁移、将细胞阻滞在G0/G1期及抑制表型转换的能力也被减弱。SAHH过表达后ERα表达明显下调;5-mC、SAM水平及SAM/SAH 比值显著升高,5-hmC及SAH水平下降;而梓醇恢复ERα的表达,抑制SAHH表达,降低5-mC、SAM水平及SAM/SAH比值,升高5-hmC及SAH水平的能力被减弱。第四章:结果显示转染si-SAHH将SAHH低表达可显著逆转AngⅡ诱导的异常增殖,并且显著增加G0/G1期细胞比例,降低S期合并G2/M期细胞比例,降低OPN荧光强度,升高α-SMA荧光强度;在给予梓醇干预后,进一步抑制了 AngⅡ诱导HVSMC异常增殖,增加了 G0/G1期细胞比例,有效地将HVSMC阻滞在G0/G1期,并抑制了收缩表型向增殖表型的转换。SAHH低表达后,AngⅡ诱导的ERα表达下调,5-mC、SAM水平及SAM/SAH 比值升高,5-hmC及SAH水平下降等现象均被逆转。而给予梓醇干预后,进一步增加ERα表达,抑制SAHH表达,降低5-mC、SAM水平及SAM/SAH 比值,升高5-hmC及SAH水平。第五章:使用Cas9-sgRNA技术构建定向DNA甲基化质粒将ESR1中CpG岛5、10、21等三个片段定向高甲基化,结果显示其中针对CpG片段5的高甲基化对ERα表达的抑制效果最为显著,而给予梓醇干预能显著改善ESR1特异性甲基化造成的ERα表达下调。在转染DNMT3a-sgRNA 5后细胞增殖迁移能力明显增强,G0/G1期细胞比例显著降低,S期和G2/M期细胞比例明显增加,OPN荧光强度显著升高,α-SMA荧光强度显著降低,说明ESR1高甲基化造成的ERα表达降低确实会导致HVSMC增殖,而梓醇可以逆转转染DNMT3a-sgRNA 5导致的细胞增殖迁移能力增强,并增加了滞留G0/G1期细胞,抑制了收缩表型向增殖表型的转换。结论:1、梓醇可以通过抑制HVSMC的表型转换,从而改善其异常增殖、迁移。2、梓醇可以通过SAHH对DNA甲基化供体的调节,通过下调SAHH表达来降低SAM,升高SAH,降低SAM/SAH比值,从而改善ESR1 DNA高甲基化状态。3、梓醇可以通过降低ESR1 DNA甲基化率,上调ERα表达,从而抑制HVSMC的异常增殖,改善绝经后AS。