牙鲆（Paralichthys olivaceus）,是一种重要的海水经济养殖鱼,雌鱼个体大于雄鱼,是研究鱼类性腺分化与发育的一种良好动物模型。长期以来,鱼类性腺分化与发育的研究一直是鱼类遗传学与发育生物学研究的重点和热点。由于两性的基因组基本相同,两性基因的差异表达可能有助于性腺的分化和发育。基因表达主要受转录水平、不同转录因子或转录后水平的调控。Micro RNAs通过与靶信使RNA（m RNAs）结合,进而诱导m RNA降解或翻译抑制,在基因表达中发挥转录后调节因子的作用。本实验室先前完成了牙鲆精巢和卵巢mi RNA的高通量测序,筛选出一批雌雄性腺差异表达和高表达的mi RNAs。在牙鲆中鉴定得到let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7h,let-7i和let-7j共10个成员,并检测了该mi RNA家族在牙鲆变态期间的表达情况。Let-7家族在哺乳动物和其他动物性腺发育中也发挥重要作用,但关于let-7家族在性腺中的作用靶点报道较少,寻找其直接作用的靶基因对于阐释let-7家族在脊椎动物性腺中的功能具有重要意义。我们也在牙鲆中鉴定了cbx2（Chromobox homolog 2）和calb2（Calretinin）基因。因此,在本研究中首先通过生物信息学方法预测了let-7家族与候选靶基因calb2和cbx2的靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因系统验证了let-7家族与cbx2的作用关系。生物信息学预测结果表明,let-7家族中只有1个成员（let-7c）的种子序列与calb2 3’UTR完全互补,而let-7家族中有5个成员的种子序列与cbx23’UTR完全互补,包括let-7b、let-7d、let-7e、let-7g和let-7j。双荧光素酶报告基因实验鉴定结果表明,cbx2是let-7b、let-7d、let-7e、let-7g和let-7j的靶基因,和预测结果相同。其中,let-7b与cbx2 3’UTR的靶向关系差异性显著（P＜0.05）,而let-7d、let-7e、let-7g和let-7j这4个成员对cbx2 3’UTR的靶向关系差异性极显著（P＜0.001）。对靶向关系差异性极显著的4个成员（let-7d、let-7e、let-7g和let-7j）的靶位点进行体外定点突变后采用双荧光素酶报告基因实验再次验证,结果显示,由于位点的突变,cbx2 3’UTR缺失与这4个成员的结合位点,不能被let-7家族mi RNAs调节。在此基础上,在4个已被证实与cbx2 3’UTR存在极显著靶向关系的let-7家族成员中,我们选择了在牙鲆性腺中表达量最高的成员let-7g。采用实时荧光定量法检测let-7g及其靶基因cbx2在牙鲆精卵巢不同发育时期的表达情况以及利用荧光原位杂交法在牙鲆精巢中对其进行定位分析。实时荧光定量分析结果显示,let-7g在精巢不同发育阶段较卵巢均显著性高表达,和高通量测序结果相一致;cbx2则在精巢不同发育阶段较卵巢均显著性低表达,符合mi RNA负向调控靶基因的理论。在性腺发育过程中,let-7g表达量在精巢和卵巢中都是先升高后降低,并且都在Ⅳ期时达到最高,在精巢中表达量最低的是Ⅱ期,而在卵巢中表达量最低的是Ⅴ期。Cbx2在卵巢中表达量先降低后升高,在Ⅳ期时表达量达到最低,而cbx2在精巢的发育过程中表达量一直升高。荧光原位杂交结果表明,cbx2在精巢中的表达模式与vasa一致,即也在精小叶的外周的精原细胞和精母细胞中能够检测到cbx2强阳性杂交信号,而在逐渐发育成熟的精小叶内部的精子细胞以及成熟精子中cbx2杂交信号较弱;let-7g定位于精巢生殖细胞中,主要包括精原细胞和精母细胞,但在其他发育阶段的生殖细胞中未检测到信号。为了进一步探讨let-7g与cbx2之间的作用关系以及let-7g在牙鲆性腺中的调控作用,在体外培养的牙鲆原代精巢细胞中开展了mi RNA过表达、抑制实验和m RNA干扰实验,并通过实时荧光定量技术检测let-7g、cbx2和sf1的表达变化。结果显示,过表达let-7g后,原代精巢细胞中let-7g的表达增加,而cbx2和sf1的表达降低;抑制let-7g后,let-7g表达降低,cbx2和sf1表达升高。Si RNA干扰cbx2后,cbx2的表达明显受到抑制,sf1的表达也受到同向抑制。通过以上结果,我们可以发现在精巢原代细胞水平,let-7g也可以负向调控cbx2,并且推测let-7g可能通过靶向cbx2调控下游基因sf1,进而在性腺分化和发育中发挥作用,为揭示let-7g在牙鲆性腺中的功能提供了有意义的基础。