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研究背景蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,S AH）是一种临床常见的神经外科急症,约占全部脑卒中的5%～10%,具有极高的致死率和致残率。据统计,SAH的死亡率高达30%,且8%-20%的幸存患者需要接受长期的医疗护理。研究证实SAH发病至72小时这一时间窗内发生的早期脑损伤（early brain injury,EBI）是导致SAH患者预后不良的重要因素。SAH后的早期脑损伤是一个十分复杂的病理生理过程,涉及了包括颅内压升高、脑水肿、细胞自噬、炎症反应等在内的诸多病理损伤机制。围绕早期脑损伤的病理生理学机制及其相关调控信号展开深入研究并研发靶向性的治疗方案,对改善SAH患者的预后具有重要意义,因此也是当前SAH领域的研究热点。干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes,STING）是一种广泛分布于哺乳动物免疫细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）,能够通过激活免疫系统进而发挥抗病毒、抑制肿瘤生长等诸多免疫防御效应。然而,STING的异常激活也被证实与急性胰腺炎、系统性红斑狼疮等多种炎症相关性疾病和自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。随着研究的深入,STING在中枢神经系统疾病中的作用也日益受到关注。最新研究证实STING在创伤性颅脑损伤、多发性硬化症等中枢神经系统疾病的病理过程中均发挥了重要的调控作用。越来越多的研究表明STING可能是治疗多种人类疾病（尤其是中枢神经系统疾病）的重要靶点。但关于STING在SAH中的作用及其相关机制,目前尚缺乏深入研究。因此,本研究将基于小鼠SAH模型并结合多种干预调控手段,深入探索STING在SAH早期脑损伤病理生理过程中的作用及其相关的分子机制,为SAH的治疗提供新的靶点和思路。实验方法第一部分采用颈内动脉线栓穿刺法构建小鼠SAH模型。将成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham组）,蛛网膜下腔出血后3小时组（SAH3h组）,蛛网膜下腔出血后6小时组（SAH6h组）,蛛网膜下腔出血后12小时组（SAH 12h组）,蛛网膜下腔出血后24小时组（SAH24h组）,蛛网膜下腔出血后48小时组（SAH48h组）以及蛛网膜下腔出血后72小时组（SAH72h组）。应用Garcia评分量表检测各组小鼠神经功能障碍情况,通过蛋白质印迹（Western blot）检测STING蛋白在上述各时间点的动态表达变化,同时采用免疫荧光双标染色明确STING在各类神经细胞中的分布情况。第二部分1.在成年雄性C57BL/6小鼠上建立SAH模型,并分别给予STING激动剂CMA和STING拮抗剂C-176调控脑内STING的功能,将小鼠随机分为以下四组:假手术+溶剂组（sham组）,蛛网膜下腔出血+溶剂组（SAH+vehicle组）,蛛网膜下腔出血+STING拮抗剂C-176处理组（SAH+C-176组）以及蛛网膜下腔出血+STING激动剂CMA处理组（SAH+CMA组）。2.比较各组小鼠的SAH出血量评分,使用干湿重法测定脑组织含水量,通过改良的Garcia量表和Tibbs量表评估各组小鼠在SAH后急性期（1天和3天）的神经功能障碍,同时通过Morris水迷宫评估小鼠远期的认知及记忆功能。利用尼氏染色和TUNEL荧光染色法评估各组小鼠神经元损伤情况,通过免疫荧光染色检测小胶质细胞激活及极化情况,Western blot 检测脑内 TBK1,p-TBK1,iNOS,IL-1β,NLRP3,ASC以及caspase-1 的蛋白表达,同时通过qPCR检测CD16,iNOS,IL-1β,IL-6,TNF-α以及MCP-1等炎症因子和趋化因子的转录水平,探索STING在SAH早期脑损伤病理过程中的作用。第三部分1.对成年雄性C57BL/6小鼠建立SAH模型后,使用C-176调控脑内STING的功能,并加用AMPK抑制剂Compound C作为预处理,将小鼠随机分为以下5组:假手术组+溶剂组（sham组）,蛛网膜下腔出血+玉米油组（SAH+vehicle1组）,蛛网膜下腔出血+STING拮抗剂C-176处理组（SAH+C-176组）,蛛网膜下腔出血+STING拮抗剂C-176+生理盐水处理组（SAH+C-176+vehicle2组）以及蛛网膜下腔出血+STING拮抗剂C-176+AMPK抑制剂Compound C预处理组（SAH+C-176+CC组）。2.通过改良的Garcia量表和Tibbs量表评估评估各组小鼠神经功能,TUNEL荧光染色法评估神经元损伤,Western blot检测TBK1,p-TBK1,AMPK,p-AMPK,iNOS,IL-1β,NLRP3,ASC以及caspase-1的蛋白表达,同时通过qPCR检测CD16,iNOS,IL-1β,IL-6,TNF-α以及MCP-1等炎症因子和趋化因子的转录水平,探索STING调控SAH后早期脑损伤的具体分子机制。结果第一部分1.SAH模型建立后72小时内小鼠出现了严重的神经功能障碍。此外,Western blot结果显示SAH发生后小鼠脑组织内STING的表达水平显著升高,并于出血后24小时达到最高值。随后,STING的表达水平缓慢下降,但在出血后72小时其表达水平仍显著高于假手术组;2.免疫荧光染色证实SAH后24小时,脑内STING染色阳性细胞的数量显著增加,并且STING主要与小胶质细胞标记物Iba-1存在明显的共表达。第二部分1.与sham组相比,SAH+vehicle组小鼠出现明显的脑水肿以及神经功能障碍,并伴有大量神经元损伤（TUNEL染色阳性神经元数量增加,尼氏染色阳性神经元数量减少）和神经炎症的显著激活（免疫荧光染色发现小胶质细胞激活并向M1表型极化,Western blot和qPCR证实CD16,iNOS,IL-1β,IL-6,TNF-α以及MCP-1 等炎症因子和趋化因子表达增多以及NLRP3炎症小体激活）;2.与SAH+vehicle组相比,SAH+CMA组小鼠上述脑损伤指标明显加重,并伴有神经炎症的进一步激活;而在SAH后应用STING拮抗剂C-176则能显著抑制小胶质细胞向促炎症的M1表型极化并抑制NLRP3炎症小体的激活,同时缓解SAH引起的脑水肿、神经元损伤,显著改善SAH小鼠短期及远期的神经功能。第三部分1.SAH发生后24小时,脑内AMPK的磷酸化水平显著上调（p-AMPK/AMPK比值增加）,应用C-176处理能进一步上调p-AMPK/AMPK的比值,而Compound C则能显著抑制AMPK的磷酸化水平;2.与SAH+vehicle组相比,应用C-176能够显著抑制SAH后的神经炎症反应,并缓解S AH小鼠的神经元损伤和神经功能障碍;3.与SAH+C-176组相比,应用AMPK抑制剂Compound C预处理显著上调了脑内CD16,iNOS,IL-1β,IL-6,TNF-α以及MCP-1等炎症因子和趋化因子表达,同时促进了NLRP3炎症小体的活化。此外,Compound C预处理进一步增加了脑内TUNEL染色阳性神经元的数量,并加重SAH小鼠的神经功能障碍。结论1.STING信号在SAH发生后被显著激活,且STING主要分布于小胶质细胞,提示STING可能通过调控小胶质细胞的功能参与了 SAH后早期脑损伤病理过程,并在其中发挥重要作用;2.应用STING激动剂CMA可显著加重SAH后的脑水肿和神经功能障碍,并且进一步加重了 SAH引起的炎症反应和神经元损伤;而STING拮抗剂C-176可显著抑制SAH引起的神经炎症反应,减轻脑水肿和神经元损伤,同时缓解SAH小鼠短期及远期的神经功能障碍,提示STING可通过介导神经炎症反应加重SAH后的早期脑损伤;3.AMPK抑制剂Compound C预处理可显著阻断C-176在SAH后的抗炎效应,同时阻断了 C-176减轻神经元损伤、缓解神经功能障碍的脑保护作用,提示STING介导SAH后的炎症反应可能与其调控AMPK激活有关。