人的听觉系统由外耳、中耳、内耳和听觉神经系统组成。听觉产生的本质是声波的机械振动转化成电信号的过程。内耳科蒂氏器官中毛细胞的静纤毛在这一过程发挥关键作用。静纤毛是毛细胞顶端特化的毛状结构,由高度组织化的平行排列的肌动蛋白纤维丝（F-actin）通过相互交联形成。发育成熟的静纤毛呈三层阶梯状排列,其中,较低两层的静纤毛顶端具有机械门控型离子通道。相邻的静纤毛之间通过顶端连接（Tip link）相连。声波（机械振动）使较低层的静纤毛向较高层位移,从而使较低层顶端的离子通道打开使细胞去极化并形成受体电位（电信号）,产生听觉。因此,静纤毛的生长发育与阶梯状分布是听觉产生的关键,但人们对这些过程的分子机制知之甚少。近年研究表明,静纤毛顶端存在电子致密区,称顶端复合物致密区（Tip complex density,TCD）,TCD 富含大量蛋白质,如 Whirlin、Eps8、Eps8L2、Myo15a、Gpsm2、Gαi 等。这些蛋白之间形成复杂的相互作用网络,调控静纤毛的生长与发育。研究表明,编码这些蛋白的基因缺失后会导致小鼠出现短小异常的静纤毛,听力严重受损;在异常静纤毛中,TCD的分布分散且不规则并伴随着肌动蛋白纤维丝的减少。在听力损失综合征如尤塞氏综合征（Usher syndrome）的病人中,科研人员筛选到大量的上述基因的突变体,提示TCD相关蛋白复合物的正确组装在静纤毛生长发育中的关键作用。更为有趣的是,细胞极性蛋白Gpsm2和Gαi仅在第一层静纤毛TCD定位,被认为是该层静纤毛发育为最高层的关键因子。因此,Gpsm2-Gαi介导的最高层TCD的组装可能是静纤毛阶梯状分布形成的核心机理。我们留意到TCD与突触后致密区（Post synaptic density,PSD）的特性极为相似。最新研究表明,PSD的形成依赖于其富含的多种蛋白之间的多价相互作用驱动的液-液相分离（Liquid-liquid phase separation,LLPS）机制。因此,我们提出静纤毛TCD的组装是通过其包含的蛋白复合物之间的多价相互作用介导的LLPS驱动这一科学假说,以期阐释调控静纤毛的生长与阶梯状排布的分子机理。为此,本论文综合采用分子生物学、生物化学、细胞生物学及结构生物学等方法,研究了 TCD多个蛋白复合物相互作用,解析了 Whirlin-Myo15a以及Gpsm2-Whirlin两个蛋白复合物的晶体结构,揭示了 TCD多个蛋白复合物相互作用的详细分子机制。重要的是,我们发现Whirlin和Gpsm2在细胞内及体外会自发形成液-液相分离。Whirlin-Myo15a-Eps8三元复合物之间存在的多价相互作用可促进LLPS的发生并介导形成TCD样的凝聚体,体外重组的TCD样凝聚体可以有效促进F-actin成束;听力损失病人中筛查到的Myo15a p9.S3525AfsX2突变体会减弱TCD样聚集体的形成并减少F-actin的成束。接下来,我们研究发现Gpsm2-Gαi会进一步促进Whirlin-Myo15a-Eps8形成LLPS的能力,其介导的五元复合物凝聚体具有更强的F-actin交联能力。研究证实,这一促进作用依赖于Gpsm2自身的LLPS。听力损失病人中发现的Gpsm2p.R318RfsX8突变体会显著破坏 Gpsm2-Gαi-Whirlin-Myo15a-Eps8 形成 LLPS 的能力,从而减少 F-actin 的交联。综上,我们阐释了静纤毛顶端致密区多个蛋白复合物的相互作用机制和结构基础,首次揭示了由LLPS介导静纤毛顶端致密区组装的分子机制,阐明了TCD在静纤毛发育过程中通过LLPS局部富集高浓度的肌动蛋白调控因子（如Eps8）,促进肌动蛋白成束,从而调控静纤毛的发育;我们进一步阐释了特异性定位于最高层静纤毛的Gpsm2-Gαi通过进一步促进LLPS的形成,促进最高层TCD样聚集体组装,从而比较低层更高效地促进肌动蛋白交联,使第一层发育为最高层静纤毛。相关研究对于解释静纤毛的形成及阶梯状排列的机制有着重大的意义,为听力损失相关疾病提供了可能的机制阐释。