论文部分内容阅读
目的:研究锰配合物AdpaMnAc([(Adpa)2Mn2(Ac)(H2O)2](Ac))诱导肿瘤细胞死亡的主要机制，进一步研究小分子HIF羟化酶模拟物一锰配合物AdpaMnCl([(Adpa)Mn(Cl)(H2O)])对肿瘤细胞糖酵解及线粒体功能的影响，探讨其抗肿瘤的可能机制，以期研发出新型靶向性的金属抗肿瘤药物。
方法:以不同浓度的AdpaMnAc处理U251、HeLa、HepG2、A549四种肿瘤细胞株48h，MTT法检测细胞的活性，计算抑制率及其IC50值，并比较正常肝细胞WRL-68和肝癌细胞HepG2对AdpaMnAc的敏感性。Westemblot检测TfR1及DMT-1的表达差异;使用去铁胺(DFO)或柠檬酸铁上调或下调TfR1，分析AdpaMnAc的抗肿瘤作用变化。通过活细胞工作站观察AdpaMnAc对H2B细胞及细胞核形态的影响，Hoechst33342染色观察细胞核的变化，Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率，分析线粒体内细胞色素C(CytoC)的表达及procaspase-9的蛋白含量，研究AdpaMnAc诱导的肿瘤细胞凋亡;通过MDC染色观察自噬小泡的形成，LysotrackerRed染色检测溶酶体的活性，LC3质粒转染检测LC3蛋白的聚集，检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1蛋白的表达，研究AdpaMnAc诱导的肿瘤细胞自噬。JC-1染色检测线粒体膜电位，荧光素酶法检测ATP含量，Clark氧电极检测细胞呼吸功能，分析线粒体的功能;Fluo-3/AM染色检测胞内钙离子含量;DCFH-DA染色检测细胞内以及线粒体活性氧(ROS)生成;检测化合物对线粒体肿胀的影响以确定其与线粒体之间的相互作用;分光光度法检测柠檬酸合酶(CS)的活性。另外，利用计算机分子模拟法分析AdpaMnCl与HIF-1α的直接结合，双荧光报告基因法检测HIF-1的活性，RT-PCR检测HIF-1α的转录水平，分析HIF-1α的蛋白水平，分析AdpaMnCl对HIF-1α的影响。进一步检测葡萄糖转运体(GLUT1)及乳酸脱氢酶(LDHA)表达，血糖仪检测细胞培养液葡萄糖的含量，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和丙酮酸激酶(PK)试剂盒分别检测LDH及PK活性，乳酸测定试剂盒和丙酮酸测定试剂盒分别检测细胞内乳酸和丙酮酸的含量分析AdpaMnCl对HepG2细胞糖酵解的影响。
结果:锰配合物AdpaMnAc能有效的抑制多种肿瘤细胞的增殖，其IC50值在8-36μmol/L左右。通过MTT检测及倒置相差显微镜观察，AdpaMnAc时间剂量依赖性的抑制A549细胞的增殖，并且对肿瘤细胞HepG2的抑制率远远大于对正常细胞WRL-68的。同时，发现这种选择性可能与AdpaMnAc的转运路径有关，通过铁转运路径被细胞摄取。AdpaMnAc能够诱导肿瘤细胞发生凋亡和自噬:细胞核皱缩，凋亡细胞数显著增加，线粒体内的CytoC减少，procaspase-9表达减少;MDC荧光强度增强，溶酶体活性增强，LC3聚集、表达增加且活化，Beclin1表达增多。用自噬抑制剂3-MA预处理细胞后，发现化合物对细胞的抑制率降低，表明自噬促进了细胞的死亡。同时，研究发现AdpaMnCl可损伤线粒体:A549细胞膜电位降低，ATP生成减少;并且AdpaMnCl可诱导细胞内Ca2+超载、ROS产生增多;AdpaMnCl可与离体线粒体外膜发生直接作用，对抗Ca2+诱导的肿胀，降低膜电位，诱导ROS产生。
另一方面的研究表明，AdpaMnCl结构与HIF-1羟化酶的活性中心相似，计算机模拟发现，AdpaMnCl能够与HIF-1α结合，进而降低HIF-1的活性，对HIF-1α的转录水平影响不大，却能够时间剂量依赖性的降低HIF-1α的蛋白水平。AdpaMnCl可以抑制GLUT1的表达，降低HepG2细胞的糖摄取量;下调LDH的活性，减少细胞的乳酸产生量;上调PK，增加丙酮酸的生成。进一步检测AdpaMnCl对线粒体的影响，发现高浓度AdpaMnCl能够损伤线粒体:能降低离体线粒体膜电位，诱导ROS的产生，降低CS的活性;诱导HepG2细胞线粒体耗氧减少，CS活性有降低的趋势。进而发现AdpaMnCl可降低HepG2细胞ATP的产生。
结论:AdpaMnAc具有良好的抑制肿瘤细胞增殖的活性，并且验证了其能通过铁转运系统转入细胞，具有一定的选择性;本研究首次发现，AdpaMnAc能够诱导A549细胞发生ROS介导的凋亡及自噬，同时能够与线粒体发生直接作用，损伤线粒体。另一方面，首次发现，HIF-1羟化酶模拟物AdpaMnCl可降解HIF-1α，抑制糖酵解;同时，又能够损伤线粒体，从而切断肿瘤的能量来源，发挥“双效”抗肿瘤的作用。总之，锰配合物的抗肿瘤机制尤其是对肿瘤能量代谢的影响，值得我们进一步探讨。