猪是一种重要的食用动物,同时生理结构的某些方面也与人非常相似,因此,猪成为了医学研究中重要的动物模型和异种器官移植及组织移植时的重要供体。但是目前还缺少有效的构建猪动物模型和细胞模型的方法,在常用的转入方法中,外源基因经常是随机整合进靶细胞的基因组中,外源基因的随机插入会破坏重要基因的功能,从而造成发育缺陷。研究和建立效率较高的转基因方法体系对培育转基因猪和构建实验猪动物模型具有重要的意义。在猪基因组内存在多拷贝的猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV),通常这些前病毒的基因序列没有功能并且与发育无关,并会随着细胞染色体的复制而复制。本研究以PERV的全基因序列为基础构建靶向基因敲入载体,利用PERV两端的LTR作为同源序列,以同源重组的方式将外源基因定向的整合到猪基因组中的PERV相应位点中,通过筛选得到稳定表达的基因整合,之后对筛选得到的细胞基因组同源重组发生位点进行PCR检测,结果证明外源基因确实以同源重组的方式整合到了细胞基因组中。此方法的成功不仅能大大提高基因敲入的效率,且会在不影响靶细胞固有基因功能的情况下,使外源基因更好的表达。研究包括以下工作：1. 同源重组PERV转基因载体的构建用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切除去了质粒pPM-1-GFP-21上面的5’LTR-ψ,通过PCR的方法从质粒pEGFP-N3上扩增得到了CMVie启动子,将其与5’LTR连接,构成了5’LTR-CMVie片段,并用其替换5’LTR-ψ,得到质粒pPCM1后通过酶切对其进行了鉴定。随后从pORF9-HSV1tk质粒上扩增得到HSVtk基因,并将HSVtk基因插入pPCM1质粒3’LTR的下游,构建得到了pPCM1-tk,并通过酶切和PCR的方法对该重组质粒进行了鉴定,结果与预期一致。分别用LipofectamineTM 2000将质粒pPCM1-tk和pPM-1-GFP-21转染293T细胞,结果显示pPCM1-tk在表达效率上要高于之pPM-1-GFP-21,说明插入的CMVie有助于提高外源基因的表达效率。2.转染试剂和细胞的筛选使用LipofectamineTM 2000脂质体将质粒pPCM1-tk分别转染ST, SK-6, PK15, IBRS2, CPK这5种猪源细胞,对转染结果进行初步观察,表明其中ST细胞和SK-6细胞的荧光表达效率较高；同时使用EntransterTM-D和X-tremeGENE HP两种转染试剂分别转染ST细胞,通过观察荧光发现,X-tremeGENE HP试剂转染效率最高并且毒性最小,可作为实验使用的转染试剂。3. 同源重组细胞的筛选使用不同浓度的G418和GANC对ST细胞和SK-6细胞进行了培养和观察,确定了G418和GANC的使用浓度和时间：对发生同源重组的ST细胞的筛选需G418(浓度为600ug/ml)培养10天,GANC(浓度为1000ug/ml)培养2天；对发生同源重组的SK-6细胞的筛选,需G418(浓度为400ug/ml)培养10天,GANC(浓度为500ug/ml)培养2天。按照上述条件对转染pPCM1-tk的细胞进行筛选之后,提取细胞基因组。4. 同源重组的检测选取4个可能发生同源重组的位点设计引物,对细胞的基因组进行PCR扩增以检测同源重组,结果显示4个位点中的3个在猪细胞基因组中是存在的,ST没有在这3个位点发生同源重组,SK-6在其中的2个位点发生了重组。由于猪的基因组内存在多个拷贝的PERV基因序列,同源重组可能发生于这3个位点之外,因此对其他位点进行检测也有可能得到阳性结果,有必要进一步的实验加以验证。综上所述,本研究成功的构建了PERV基因靶向载体pPCM1-tk,将该载体转染猪源细胞ST和SK-6后,筛选得到同源重组的细胞,并利用PCR的方法检测同源重组的发生位点,证明了利用PERV靶向载体构建转基因细胞这种方法的可行性。