前言 随着细胞化学及细胞生物学的发展，自70年代开始，人们逐渐发现到诸多激素及生长因子都对软骨细胞的生物学行为产生作用。诸如胰岛素样生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子、白介素及肿瘤坏死因子等。在这些因子中bFGF作用最为广泛，其不仅对源于中胚层和神经外胚层细胞具有强大的促有丝分裂活性，而且对其他外胚层细胞及内胚层衍生物也有促进有丝分裂活性。但是bFGF对组织工程软骨细胞是否有影响，至今尚未见报道。本实验采用bFGF与兔关节软骨细胞-聚乳酸(PLA)支架复合物共同体外培养，了解其对关节软骨细胞的作用，为关节软骨缺损的修复提供实验依据。 实验材料 1．主要仪器：超净工作台，二氧化碳细胞孵育箱，光学显微镜、倒置显微镜及照相系统、电镜，50ml玻璃培养瓶，一次性24孔、96孔培养板，恒温振荡箱，显微手术器械等。 2．主要试剂：高糖型DMEM培养基，bFGF，聚乳酸，卵磷脂，多聚赖氨酸，胎牛血清，Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶，免疫组化试剂盒，Ⅱ型胶原抗体等。 3．实验动物：4周龄新西兰大白兔，购自医大二院动物实验室。 实验方法 1．关节软骨细胞悬液的制备 无菌条件下分离2周龄新西兰大白兔的四肢长骨，切取关节透明软骨，用眼科剪剪成约0．5刁’大小碎块，I型胶原酶消化4小时，不锈钢筛网过滤、离心，收集关节软骨细胞，以 3－5 X 10勺瓶种植于50Inl培养瓶，加人DMEM培养液SInl，培养箱内培养。当细胞生长至约90％融合时，胰蛋白酶消化，以乙2传代，收集第三代软骨细胞，离心后，制成细胞悬液，浓度为＊ 5 X 10Vul。 2．聚乳酸三维支架的制备 将多子聚琴酸（Polyl。CtiC。Cid，PLA）载体膜分另以 1见的卵磷脂（Lecithin，LEC八元水乙醇溶液及10％多聚赖氨酸（POlyJJysine，PLYS）包埋，乃％酒精及紫外线消毒，无菌孔钻裁剪支架成直径为4．srnm的圆形结构，电子天平称重、记录备用。 3．关节软骨细胞的种植及培养 实验组、对照组随机选取各20枚多孔聚乳酸三维支架，将高浓度细胞悬液20ul均匀滴加到支架上，培养箱内静置4小时后，移人96孔板，加人DMEM培养液200ill，同样条件培养箱内培养48小时后，将细胞一支架复合物移人24孔板，每孔一个，每孔加人DMEM培养液Zrlil继续培养，隔日换液。实验组培养液中加人bFGF，浓度为 10ng／Inl，对照组培养液不加人 bFGF，其余培养条件相同。 4．观测指标 O）大体及倒置显微镜观察 K）组织学光镜观察 根）电镜观察 N）D型胶原免疫组化检测 ·2· O）细胞含量测定 的）统计学分析 实验结果 （一）大体及倒置显微镜观察 二周后支架周缘有蜘蛛状胶原基质生成。随着培养时间的延长，细胞支架复合物的透光度逐渐降低，2周后，只有周缘可见到细胞结构，清晰基质陷窝形成。通过分泌的基质，细胞与细胞，细胞与支架之间紧密结合，形成一个牢固的整体。 （二）组织学光镜观察 培养1周后细胞一支架复合物表面为1－3层梭状细胞，内部细胞呈圆形。HE染色显示细胞大部呈圆形或多角形，胞浆丰富红染，胞核蓝染。胞浆内有圆形透亮区，为细胞分泌的胶原泡。随着培养时间的延长，细胞量逐渐增多。实验组细胞数明显多于对照组。 （三）电镜观察 PLA支架表面粗糙不平，具有很多沟隙。第H周支架表面与间隙间有处于不同时期的软骨细胞，细胞形态大多近似球形，突起多的细胞如同桑整状，对照组与包埋组细胞密度及分泌物的量有差别。第四周时明显可见多数细胞之间通过细胞突起和细胞所分泌的细胞外基质相互连接，连成一个整体，并与支架结合紧密。加人bFGF组软骨细胞生长密度及基质分泌更加旺盛。 （四）血型胶原免疫组化检测 11型胶原免疫组化显示，各时相点细胞一支架复合物11型胶原均呈阳性，二周时稍弱，2周以后阳性着色均很强，呈递增趋势。相同时相点，实验组阳性表现明显强于对照组。 （五）细胞含量测定 ·3· 分别测定各组数值后制成图表 统计学数据显示，实验组与对照组细胞数量及其分泌胶原基质均明显增加，而二者净增重相比有显著差异K＜0．01人 讨 论 组织工程研究需要具备三个主要条件：门）功能正常且具有足够数量的种子细胞。闪）适当的细胞外基质材料。闷）调节细胞增殖、保持细胞表型等特征的细胞因子。 聚乳酸kLA）支架亲水性及细胞吸附性弱，影响种子细胞的三维扩散和吸附，细胞容易脱落，科研人员一直探索各种方法解决这一问题。有人将PGA与PLA按一定比例混合合成人工支架，或者采用藻酸盐、11型胶原包埋PLA支架，但结果仍不满意。我们前期实验应用多聚赖氨酸和卵磷脂共同包埋PLA支架获得理想结果。为更进一步调节组织工程软骨