肝的免疫耐受状态与肝脏疾病的发生和发展密切相关,它不仅可以在免疫性肝炎中发挥作用,也可以决定感染性肝脏疾病的免疫应答程度。如严重危害生命健康的乙肝、丙肝,由于机体免疫系统对病毒及其抗原反应低下或特异性耐受,患者临床表现为持续病毒感染状态,肝脏长期存在慢性炎症与肝细胞增殖性改变,最终发展为肝硬化、肝癌,若将耐受状态逆转为应答状态则可有效清除肝炎病毒,改善疾病症状;另一方面,肝免疫耐受的成功诱导能延长移植肝的存活,是提高生存质量的重要手段。近年来,在对自身免疫性肝炎发病机制的研究中发现,机体在易感性基因的作用下,受环境因子、药物或感染因子的诱导,导致肝自身免疫耐受状态削弱,产生针对肝细胞膜自身靶抗原的细胞免疫与体液免疫反应,造成自身免疫性肝损伤。如何抑制自身免疫应答,维持免疫耐受状态,是目前的研究热点。调节性T细胞因其在维持机体自身免疫耐受状态中的关键作用而日益受到重视,根据来源及功能不同,调节性T细胞可分为多个亚群,包括CD4~+ CD25~+调节性T细胞、Tr1(Tr1 regulatory T cell,Tr1 cell)调节性T细胞和Th3等,它们的功能异常是自身免疫性疾病如类风关、自身免疫性肝损伤等的重要的免疫学发病机制,其中Tr1调节性T细胞(Tr1细胞)在自身免疫性疾病中的抑制作用备受关注。Tr1调节性T细胞以高分泌IL-10为主要特征,具有低增殖性,主要通过其分泌的IL-10抑制初始和记忆性Th1和Th2的反应。另外,在外源IL-10的刺激下初始CD4~+ T细胞可以被诱导为Tr1调节性T细胞。已有研究证明Tr1细胞在口服和系统性全身免疫耐受中均发挥重要作用,但Tr1细胞在肝免疫耐受中的作用及其机制研究甚少。基于此,为了阐明Tr1细胞在肝脏免疫耐受中的作用,我们建立了ConA诱导的小鼠肝免疫耐受模型,探讨Tr1调节性T细胞在其中的作用及其机制,以期为自身免疫性肝炎的治疗和维持肝移植的免疫耐受提供实验和理论依据。第一部分ConA诱导的小鼠肝免疫耐受模型的建立我们以亚致死剂量ConA预处理、致死剂量ConA再次攻击小鼠建立肝免疫耐受模型。第0天,以亚致死剂量ConA预处理Balb/c小鼠,生理盐水预处理组作为对照,第8天分别给予两组小鼠致死剂量ConA诱导小鼠急性肝损伤,再次ConA给予8小时后检测血清转氨酶(ALT)和肝病理损伤的变化。从血清学指标来看,ConA预处理组小鼠血清转氨酶(ALT)水平较生理盐水预处理组小鼠显著降低;小鼠肝组织病理检查结果显示,ConA预处理组仅有极少的炎性细胞浸润,生理盐水预处理组显示大量浸润的炎性细胞在肝组织扩散并导致局部肝细胞坏死。因此通过以上结果证明我们成功诱导了肝免疫耐受,建立了ConA诱导的肝免疫耐受模型。第二部分Tr1调节性T细胞在ConA诱导的肝免疫耐受模型中的作用在成功建立ConA诱导的肝免疫耐受模型的基础上,我们聚焦在T淋巴细胞,观察脾脏中T淋巴细胞数量和比例的变化,结果发现:与对照组相比较,ConA预处理组的CD4~+ T和CD8~+ T细胞绝对数目明显增加,ELISA和流式检测的结果均提示CD4~+ T细胞具有Tr1调节性T细胞表型(IL-10~+,IL-4~-,IFN-γ~-,Foxp3~-);同时,胞内细胞因子染色检测发现Tr1调节性T细胞在肝脏和脾脏中的比例明显升高,且细胞表面高表达CD69和CD44分子,呈现活化表型,提示处于效应状态。为了解Tr1细胞亚群在抵御ConA诱导的急性肝损伤中的作用,我们将ConA预处理组的CD4~+ T细胞转输正常小鼠,发现经转输具有Tr1调节性T细胞表型的ConA预处理组的CD4~+ T细胞的小鼠,可以抵御致死剂量ConA的攻击;更进一步,我们以体外诱导的Tr1调节性T细胞过继转输正常小鼠,以致死剂量ConA诱导急性肝损伤,同样发现转输Tr1调节性T细胞能显著抵御致死剂量ConA的攻击,保护肝脏免受损伤。这些结果充分提示ConA诱导的肝免疫耐受模型通过诱导Tr1调节性T细胞发挥免疫抑制效应,介导肝免疫耐受。第三部分Tr1调节性T细胞在ConA诱导的肝免疫耐受模型中的作用机制为验证Tr1调节性T细胞通过分泌IL-10发挥免疫抑制效应,我们以IL-10阻断抗体体内作用,发现可以显著逆转Tr1调节性T细胞对ConA诱导的急性肝损伤的保护效应,表明Tr1调节性T细胞是通过抑制性细胞因子IL-10发挥其免疫调节作用的。进一步,为探讨DCs在诱导Tr1调节性T细胞中的作用,我们检测了ConA诱导的肝免疫耐受模型中DCs的成熟度和其分泌的细胞因子,结果发现ConA诱导的肝免疫耐受模型中DCs表现不成熟表型,并分泌较高量的IL-10,这一结果提示在肝免疫耐受模型中DCs不成熟和分泌较高量的IL-10可能参与了Tr1调节性T细胞的产生。因此,我们进一步分选了肝免疫耐受模型中CD11c~+DC细胞和na(?)ve CD4~+T细胞共培养,观察其是否可诱导Tr1调节性T细胞,结果发现肝免疫耐受模型中的CD11c~+DC细胞可以有效诱导Tr1调节性T细胞的产生;加入IL-10阻断抗体,可以逆转此作用。以上结果表明Tr1调节性T细胞主要通过IL-10发挥免疫调节作用,并且ConA诱导的肝免疫耐受模型中分泌IL-10的未成熟DCs参与了肝免疫耐受模型中Tr1调节性T细胞的诱导产生,这可能是ConA诱导的肝免疫耐受模型中Tr1调节性T细胞增加并发挥效应的一个重要机制。通过上述研究,我们得到以下的结论:1.成功建立ConA诱导的小鼠肝免疫耐受模型,明确了肝免疫耐受模型诱导了Tr1调节性T细胞,且呈活化表型。2.Tr1调节性T细胞可以抵御ConA诱导的小鼠急性肝损伤,并通过其分泌细胞因子IL-10发挥抑制作用。3.ConA诱导的小鼠肝免疫耐受模型通过不成熟DC分泌IL-10诱导了Tr1调节性T细胞的产生。本研究阐明ConA诱导的肝免疫耐受模型通过不成熟DC分泌IL-10诱导了Tr1调节性T细胞的产生,并对致死剂量ConA的攻击产生显著的免疫保护效应,为临床应用以免疫抑制细胞如Tr1调节性T细胞治疗自身免疫性肝病提供新的思路和实验依据。