目的:第一部分:在血液系统的疾病中,我们常常最需要诊断的一类为全血细胞减少症,而其中免疫相关血细胞减少症(IRP)作为以骨髓衰竭为表现的疾病体系被细分出来,近年来研究表明其发病机制是由于机体受到某种未知病原的刺激后,树突细胞亚群作为主要的呈递抗原率先出现异常,随后传递至T淋巴细胞,再导致下游的B淋巴细胞在功能、数量及亚群等各方面出现不同程度的异常,从而形成自身抗体,而这类自身抗体可以专门针对骨髓的造血细胞,它们可以通过封闭造血细胞膜上的功能蛋白、或通过激活补体原位溶血、亦或可通过介导巨噬细胞吞噬等多种途径导致骨髓的造血细胞增殖分化被抑制,最终导致机体无效造血,骨髓出现衰竭[35]。所以尽快的正确诊断,将IRP与其他不同种类、不同治疗方案的全血细胞减少症鉴别出来至关重要。近年来大量的实验研究都集中在细胞核内的基因组遗传物质与血液疾病的是否存在相关性,本试验检测的线粒体DNA中的D-环区着眼于细胞核外DNA的突变与免疫性血液系统疾病是否同样存在相关性,立志于为疾病的临床诊断与发病机制提供新的思路。线粒体作为高等动物细胞内除细胞核外的唯一含有DNA的细胞器,且不依赖基因组进行复制、转录及翻译。尽管如此,但是当线粒体DNA长期在氧化磷酸化中裸露时却极其容易被周围的氧自由基等物质所损伤,这主要是由于其缺乏有效的抗氧化修复机制,大量研究表明其同样缺乏与组蛋白的有效结合,因此无法获得组蛋白保护,导致线粒体DNA的与细胞核DNA相比,远高于10倍以上。目前大量研究也表明,线粒体DNA的损伤氧化与肿瘤的发病风险、疾病的预后、人类糖尿病等慢性疾病以及人类衰老等多方面存在相关性。此外,线粒体DNA的变异还会影响线粒体呼吸链功能的障碍从而导致机体多种免疫相关性疾病发生。其中的D-环区位于线粒体DNA的t RNApro与t RNAphe之间(nt16024-nt575)总长度约为1120bp左右,为线粒体DNA主要的非编码区域,是线粒体DNA内最大的遗传变异区域,D-环区还是线粒体DNA复制与转录的调控区,以及线粒体DNA的轻链与重链的开始位点也均在D-环区,因此近年来对该区域的探索成为对线粒体DNA研究的重点区域。单核苷酸多态性(SNP),研究认为其在DNA序列的变异中是极为常见的,在高等动物的基因组内变异频率通常可﹥1%,它主要是由于DNA序列上单个核甘酸的变化导致的基因组序列的多态性,比例在已知的所有多态性中占有90%以上。因此SNP被认为与物种的多样性、与药物治疗个体差异、与某些疾病的易感性均存在相关因素。由于人类的基因组是存在连锁不平衡的,所以,尽管大多数的SNP不会直接的影响到对基因产物的表达,但是其依旧会被大多数学者当成遗传标记的一个类别来深入研究,当某些可以导致疾病的基因其在功能上或在结构上产生变化时,我能仍可以将SNP用于定位这些临近的基因或基因组。如果SNP恰好位于某些基因的启动子中,其功能起着对该基因进行编码及调控时,那么此时的SNP就有可能会对此基因造成影响。而本次将要研究的D-环区域线粒体DNA复制的控制区、线粒体DNA的轻链及重链的复制起始点以及承担调控线粒体DNA转录和复制的重要区域,其遗传上的高度多态性势必会对线粒体产生一定的影响。因此我们进行了对免疫相关性血细胞减少症(IRP)患者外周血淋巴细胞线粒体DNA(mtDNA)D-环区多态性的意义、与免疫指标相关性以及与患者骨髓及外周血细胞形态学特征相关性的研究。第二部分:幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia,PLL)为一种特殊类型的淋巴细胞白血病,一般认为属罕见的慢性淋巴细胞白血病的变异型,但也有人认为是急淋的一种(Ⅱ型)。Auer小体是急性髓系白血病一个具有诊断意义的形态学特征,其在急性髓系白血病的检出、分布情况及与疗效的关系有诊断性的临床意义。而我们此次探讨的是在幼淋巴细胞白血病细胞的胞浆中出现了形态学类似Auer小体的Auer小体样内含物的特征。方法:第一部分:1.提取43例初治IRP患者及41例正常对照者外周血淋巴细胞的线粒体DNA,对所有样本的D-环区域采用PCR扩增的方法,并通过正向及反向直接测序对其D-环区域的PCR扩增产物基因序列进行检测,将检测出的结果与人线粒体DNA文库记录的剑桥序列以及mt DB数据库的Polymorphic Sites子数据库相关数据库进行对比。2.利用流式细胞术(FACS)检测43例初治IRP患者的骨髓造血细胞CD15+、Gly Co A+细胞以及CD34+细胞膜表面抗体的阳性率(Ig G与Ig M)3.利用流式细胞术(FACS)检测43例初治IRP患者的外周血B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群阳性率4.利用瑞氏染色法对43例初治IRP患者的骨髓涂片,计数200个骨髓细胞,分别记录其骨髓的小粒、油滴、增生程度、粒红系比例及病态造血情况、淋巴细胞比例、巨核细胞数量以及血小板等5.利用利用瑞氏染色法对43例初治IRP患者的外周血涂片,计数100个白细胞,分别记录其粒细胞比例、成熟红细胞、淋巴细胞比例、单核细胞比例以及血小板等第二部分:用显微镜观察骨髓细胞形态学、细胞化学染色的特点,用流式细胞术检测骨髓细胞的免疫表型,用电镜扫描分析其成份。结果:1.43例IRP患者的外周血淋巴细胞线粒体DNA D-环区中共有110个变异位点,其中62个为多态位点(SNP),48个为突变位点,其中14个位点为数据库中未提及的新突变位点。2.110个变异位点中共发现516个碱基改变,最主要改变是410个碱基置换,常见的碱基置换为T/C(184/410)和A/G(113/410)3.110个变异位点中高频变异位点73和263,其变异率为43/43,位点311的变异率为32/43,位点310和16224的变异率为27/43,16519的变异率为25/43,位点489和16362为24/43。4.IRP患者外周血淋巴细胞线粒体DNA D-环区多态性与该类患者骨髓单个核细胞的相关性统计中发现,以年龄18岁为界的35例成年组中其淋巴细胞线粒体DNA D-环区多态性与患者骨髓单个核细胞的CD15Ig M、Gly Co A+细胞Ig M、CD34+细胞Ig G、CD34+细胞Ig M存在显著正相关性。5.骨髓细胞形态学提示为幼淋巴细胞白血病,部分胞浆中见有Auer小体样内含物,细胞化学染色及流式细胞术分析亦为B淋巴细胞,电镜扫描其为基质密度增高,内部结构消失的变性线粒体。结论:1.IRP患者外周血淋巴细胞的线粒体DNA D-环区存在高频突变。2.最主要的碱基改变类型为T/C以及A/G3.高频突变位点分别为73、263、311、310、16224、16519、489以及163624.且在成年组(年龄≥18岁)中与骨髓单个核细胞膜结合自身抗体显著正相关,可能是免疫相关性血细胞减少症发病机制中的重要环节。5.在淋巴系统的肿瘤细胞胞浆中变性的线粒体经瑞氏染色后可呈现Auer小体样内含物。Auer小体在形态学上是非常有价值的发现,但不能仅通过形态学观察,还应结合其他相关检查进一步对白血病细胞的类别分型。