研究背景胰腺癌是消化道常见疾病之一,因其解剖及病理的特点,也是临床预后最差的肿瘤之一,五年生存率不足5%。新的临床治疗方法不断出现,但是目前唯一有效的方法还是早期手术治疗。胰腺癌的基因突变发生率极高,DNA损伤修复异常导致的染色体不稳定性是胰腺癌早期转移、化疗耐药、预后极差的重要原因。有研究指出DNA复制叉的翻转是细胞应对DNA损伤造成复制压力的重要保护手段,参与维持染色体的稳定。其机制与人类肿瘤疾病发生发展以及抗肿瘤药物耐药等关系密切。因此了解其中的机制,可能为寻找胰腺癌新的治疗方式提供方向。目的TIP39参与DNA损伤修复,但是目前研究尚少,此外关于TIP39如何参与DNA损伤压力的应答,以及在胰腺癌中的作用也知之甚少。本研究主要目的是阐明TIP39参与复制压力下DNA复制叉翻转过程中的作用及机制,以及和胰腺癌发生发展、预后的关系,为进一步研究TIP39在胰腺癌及其他肿瘤中的保护机制及开发新的药物及治疗靶点提供基础。方法本研究主要采用羟基脲处理细胞诱发细胞DNA复制压力模型,用细胞转染模拟细胞功能蛋白缺失模型;通过新生DNA链上的蛋白质分离实验、邻位连接技术实验验证了TIP39是否会被招募到DNA压力下的DNA复制叉上;用原生Brd U免疫荧光标记实验以及电子透射显微镜技术证实了TIP39对复制叉翻转的作用;通过DNA单纤维分析实验观察研究了在敲减TIP39细胞中,DNA复制叉的变化,阐明了TIP39在影响复制叉翻转过程中具体机制。本研究还通过生物信息学、免疫组化以及临床资料,分析了TIP39对胰腺癌发生发展,以及预后的作用。结果本研究发现,当遭遇DNA损伤诱发的复制压力时,TIP39会被招募到DNA停滞的复制叉上。并且该招募需要TIP39通过结构域连接RPA1相互作用后实现。通过电子透射显微镜我们直接发现了TIP39可以促进停滞复制叉翻转的证据,并通过原生Brd U免疫荧光标记实验间接验证。此外,通过DNA单纤维分析实验,我们发现了TIP39在复制叉翻转过程中,可以调节复制叉进程的速率,维持叉翻转和重启的平衡,促进复制叉有效翻转,并在BRCA2突变的复制叉降解过程中起重要作用,对于细胞应对复制压力提高耐受能力,维持染色体的稳定具有核心作用,而这些作用又是通过TIP39与RPA1、RAD51、BLM相互作用实现的。TIP39主要通过与这些蛋白的相互作用,调控促进复制叉的翻转。TIP39的保护作用不只局限于细胞,它与胰腺癌的发生发展以及预后也有重要联系。本研究通过对110例人胰腺癌病例的病理切片免疫组化分析以及回访资料的研究发现,TIP39在胰腺癌组织中低表达,并且它的表达与胰腺癌的预后成正相关。最后,我们通过生信分析以及胰腺癌细胞生存实验发现,TIP39在BRCA2缺陷的肿瘤中,对维护染色体稳定,维护细胞功能起重要作用。结论TIP39参与应对复制压力,促进复制叉翻转,这是本研究首次发现细胞调控复制压力下复制翻转过程,维持染色体稳定的新机制。此外,TIP39表达高低与胰腺癌病人预后相关,高表达病人预后更好。同时敲减TIP39和BRCA2后,胰腺癌细胞对化疗药物更敏感,为我们开发胰腺癌新的合成致死药物,以及发现新的治疗靶点提供了新思路和策略。