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补肺益肾方由人参、淫羊藿、赤芍、陈皮、枸杞子等十二味中药组成,具有补益肺肾、纳气平喘、化痰止咳的功效,是中医治疗慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)稳定期肺肾气虚证的有效药物,可减轻炎症反应和粘液分泌,减少对气道壁的损伤,减轻气道阻塞,从而降低对肺组织的损伤,延缓肺功能的下降。中药指纹图谱-药效学(谱-效)相关性研究是将中药指纹图谱中标示活性成分的特征峰数据与药效结果对应起来,将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效联系起来的研究方法,是开展中药药效物质基础研究的重要模式。因此,开展补肺益肾方的谱-效相关性研究,是揭示该复方药效物质基础并明确其作用机制的有效途径。
目的：
以补肺益肾方为研究对象,优选该方药的提取工艺；建立补肺益肾方全方、拆方的HPLC指纹图谱；分别以香烟烟雾提取物(Colombo Stock Exchange,CSE)和脂多糖(Lip Polysaccharide,LPS)刺激肺泡上皮细胞株A549细胞为研究模型,进行药效学实验,阐释补肺益肾方及其拆方调控A549细胞炎症反应的效应及其特征；对得到的指纹图谱特征峰信息和药效指标数据进行相关性计算,阐明指纹图谱数据与药效特证信息的相关性,为揭示补肺益肾方的药效物质基础及作用机制提供依据。
方法：
1 对补肺益肾方中人参、枸杞子等药材用水提醇沉法提取,采用L9(34)正交设计实验,以人参皂苷Rg1、Re、Rb1的总含量为指标,考察加水量、煎煮时间、煎煮次数及醇沉浓度对提取工艺的影响；对方中淫羊藿、赤芍等药材用乙醇回流提取,采用L9(34)正交试验法,以淫羊藿苷、橙皮苷、芍药苷含量为指标,考察乙醇浓度、乙醇用量、回流时间和回流次数对醇提工艺的影响,优化提取条件。
2 对补肺益肾方进行拆方,通过筛选高效液相色谱条件,根据化学指纹图谱研究的要求,运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件,建立补肺益肾方及其拆方的HPLC指纹图谱,并对各色谱峰进行归属,找出药材来源及所代表的化学成分。
3 分别以 CSE 和 LPS 刺激 A549 细胞,MTT 法筛选出最佳的刺激浓度后, A549细胞按孔平均分为正常组(20%正常大鼠血清)、刺激组(20%正常大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)、用药组(20%补肺益肾各拆方组大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)安排实验,用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)法检测A549细胞对粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-3、IL-8、IL-1β)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-9 及其抑制物-1 (MMP-9 和 TIMP-1)、酶磷脂酸脂肪酶 2B (PPAP2B)、脂肪酸转位酶(CD36)、超氧化物歧化酶(SOD)的分泌及变化情况。
4 采用双变量相关分析方法,将补肺益肾方各拆方组HPLC指纹图谱的峰面积进行量化,与ELISA法测得的各拆方组血清干预A549细胞炎症因子的结果相结合,计算pearson相关系数,并对相关性进行分析,构建补肺益肾方“化学谱”–“药效”关系。
结果：
1 补肺益肾方最佳提取工艺为：人参等药材采用水煎煮提取,加 12倍量水,煎煮2次,每次60 min,浓缩液加95%乙醇至含醇量为70%,静置12 h,取上清液回收乙醇,浓缩；淫羊藿等药材采用乙醇回流提取,加 8 倍量的 60% 乙醇溶液,回流两次,每次 60 min,回收乙醇,浓缩；合并水提和醇提浓缩液,减压干燥。
2 补肺益肾方HPLC指纹图谱研究表明：十批样品指纹图谱间的相似度均达到0.90以上,全方确定了71个共有峰,其中指认出熊果酸、岩白菜素、马钱苷、芍药苷、淫羊藿苷、五味子甲素、五味子乙素、人参皂苷、贝母素甲、贝母素乙等二十个成分,并对各色谱峰的药材来源进行了归属。
3 ELISA 结果显示：与正常组比较,A549 细胞 CSE 组 MMP-9 浓度升高(P<0.05),IL-3、IL-8(P<0.05)和TGF-β(P<0.01)浓度降低；LPS组TIMP-1浓度升高(P<0.05),IL-3、TGF-β 浓度降低(P<0.01)。补肺益肾各拆方组均可纠正 CSE 对 A549 细胞分泌 IL-1β、TGF-β、PPAP2B、CD36 和 LPS 对细胞分泌 IL-3、SOD的影响；除第11组全方外,其它各拆方组均可以纠正CSE对A549细胞分泌TNF-α和LPS对细胞分泌TNF-α、TGF-β的影响。
4 谱-效相关性研究表明：补肺益肾方指纹图谱中 43、55 号峰(淫羊藿)、66号峰(五味子)、28、47号峰(陈皮)、27号峰(矮地茶)、9、15、24号峰(赤芍)等成分,对矫正 CSE刺激下 A549细胞分泌 GM-CSF、IL-3、MMP-9、PPAP2B等因子的含量改变有显著的相关性；但指纹图谱中的10号峰(枸杞子)、8号峰(矮地茶)、31号峰(陈皮)、5号峰(山茱萸)等成分,对矫正CSE刺激下 A549 细胞分泌因子的改变作用较小或呈相反的相关性。补肺益肾方指纹图谱中28、47号峰(陈皮)、6、29号峰(矮地茶)、52号峰(人参)、68号峰(五味子)等,对矫正 LPS 刺激下 A549 细胞分泌 TNF-α、MMP-9、SOD、CD36 等
因子的浓度变化有显著的相关性；但指纹图谱中的5号峰(山茱萸)、9号峰(赤芍)、70 号峰(浙贝母)、60 号峰(陈皮)等成分,对矫正 LPS 刺激下 A549细胞分泌因子的改变作用较小或呈相反的相关性。
结论：
1 正交试验优选出的补肺益肾方提取工艺稳定、高效、简便易行,为后期新药研发的制剂工艺奠定了基础。
2 HPLC法建立了补肺益肾方及其拆方的指纹图谱,并对其进行评价分析, 10批次样品间指纹图谱的相似度均大于0.90,全方共确定了71个共有峰,均找出了药材来源,并指认出熊果酸、岩白菜素、马钱苷、芍药苷、淫羊藿苷、五味子甲素、五味子乙素、人参皂苷、贝母素甲、贝母素乙等二十种化学成分,可以对复方药材质量进行鉴别,以达到控制补肺益肾方品质和药效的目的。这与传统的以单一或某几个化学成分对复方的质量进行控制的方式相比,更能很好地反映复方的质量。
3 CSE和LPS刺激对肺泡上皮细胞A549分泌细胞因子均有一定程度的影响,补肺益肾含药血清对 CSE 和 LPS 刺激下细胞因子分泌量的改变有一定的调节作用,其中对CSE刺激下A549细胞分泌IL-1β、TGF-β、CD36、MMP-9、PPAP2B和对LPS刺激下A549细胞分泌TIMP-1、IL-3、SOD的调节最为明显。不同刺激物对细胞的因子的影响不同,同一刺激物下不同拆方组含药血清对细胞因子的影响也不同,这为阐明补肺益肾方的作用机制奠定了基础,也为寻找该复方的药效物质基础提供了思路。
4 谱-效相关性研究表明,补肺益肾方中人参、黄芪、淫羊藿、陈皮、赤芍等药材中主要成分对矫正A549细胞炎症因子的浓度变化有显著的相关性；而山茱萸、枸杞子、五味子等药材主要成分对调控A549细胞炎症因子改变作用较小或呈相反的相关性,这为精简处方提供了思路,有待对其进一步深入研究。由相关系数的大小推断,人参、淫羊藿在调控A549细胞炎症反应中起主要作用,在方中占主药地位,黄芪、陈皮、赤芍、浙贝母等处于从属地位,这为中医理论君臣佐使药的划分提供了数据支持。