背景中暑（HS）是一种危及生命的疾病,肝脏是重症HS常见的主要损伤靶器官,大约31.9%的HS患者出现肝功能损害。而严重的HS-肝功能衰竭（ALF）死亡率>70%。然而,HS的肝损伤机制尚不明确。目前主流观点认为肝细胞的原发物理化学损伤为后,启动肝脏中免疫细胞（如巨噬细胞）继发的失衡的炎症反应,扩大损伤。外泌体是一种新的细胞间通讯机制,研究表明非酒精性脂肪性肝炎及酒精性肝炎中,肝细胞分泌外泌体数量增加,其含有独特内含物并具有促炎作用,能活化巨噬细胞,促使M1表型转化,进一步加重肝脏炎症反应。目的探讨热打击后肝细胞外泌体的释放,其是否能被巨噬细胞摄取并介导其向促炎的M1表型转化,在体内是否也通过促进巨噬细胞炎症表型介导肝损伤及肝脏炎症。另外通过蛋白质谱筛选HS肝细胞外泌体感兴趣的内含物,验证其在介导外泌体促炎功能的作用,及在供体细胞的富集机制与在受体细胞的作用机制。最后在临床研究中验证血浆外泌体中目标蛋白对中暑合并肝损伤的早期诊断及预后评估效能。方法1.通过超高速梯度离心法分离HepG2肝细胞上清、动物及中暑患者血浆的外泌体,通过透射电镜、NTA鉴定外泌体形态及直径分析,Western-blot检测外泌体上特征性表面标记物CD9、CD63、CD81、Tsg-101及内质网指标gp96的表达。2.用PKH67荧光标记外泌体,通过直接吸收实验验证肝细胞外泌体被巨噬细胞的摄取。3.通过流式细胞术分析巨噬细胞M1/M2表型表面标记物的表达。4.PCR方法测定巨噬细胞M1/M2相关炎症因子的mRNA水平。5.ELISA方法测定HS肝细胞外泌体、血浆外泌体、细胞上清及血浆中组蛋白H3水平,细胞上清及血浆中巨噬细胞M1/M2相关炎症因子水平。6.通过尾静脉注射外泌体（40ug）构建外泌体回输模型。7.尾静脉注射PKH-67标记的外泌体后取各脏器行冰冻切片,观察外泌体体内摄取;在肝脏中与F4/80标记的巨噬细胞共定位。6.肝组织的HE/MPO/F4/80染色检测肝损伤。7.试剂盒检测细胞上清及血浆中ALT、AST和LDH的含量。8.iTRAQ蛋白质谱分析HS后肝细胞外泌体蛋白表达谱的差异。9.通过共聚焦显微镜分析组蛋白在肝细胞的核转位、与TLR4、EEA1、Rab5、Rab7的共定位,PKH-67标记的外泌体与巨噬细胞EEA1、Rab5、Rab7、Lamp1的共定位。10.通过Western-blot分析肝细胞胞浆Alix、Tsg101、组蛋白H3,胞核组蛋白H3的表达。11.慢病毒构建组蛋白H3过表达的肝细胞株。12.siRNA敲低肝细胞组蛋白H3、TLR4、caspase-3、巨噬细胞网格蛋白、TLR9,及在体内敲低TLR9。13.全capase抑制剂抑制肝细胞凋亡,Nacrostatin抑制坏死性凋亡,TLR9激动剂（ODN1688）、TLR9抑制剂（ODN2088）、阴性激动剂（CpG-ODN）分别处理巨噬细胞,体内进行腹腔注射。外泌体抑制剂GW4869作用于巨噬细胞,体内尾静脉注射。14.体外THP-1细胞加入PMA刺激向巨噬细胞分化。15.氯磷脂质体腹腔注射清除体内巨噬细胞。17.HS肝细胞模型:肝细胞置于43℃、湿度60%孵箱中热打击1h,随后分别复温0、3、6、9小时;HS小鼠模型:C57小鼠置于42.5℃、湿度60%孵箱中热打击1h,随后分别复温0、3、6、9、12、24小时。18.结果处理采用SPSS 17.0统计软件,以百分比（%）、平均值±标准差（x±s）或中位数±25～75百分位数表示。两组均数的比较使用两独立样本t检验。相关性分析使用Pearson检验。统计值P<0.05,具有统计学意义。结果1.热打击诱导肝细胞释放大量外泌体,其通过内吞途径被巨噬细胞摄取并诱导巨噬细胞向M1表型转化1.1经超高速梯度离心法分离的肝细胞外泌体,无论从形态、直径分布,或是表面标记物的表达,均符合外泌体典型特征,且纯度较高;1.2热打击后肝细胞分泌外泌体数量增多,与肝细胞损伤程度呈正相关性;1.3肝细胞外泌体在体外可通过网格蛋白介导的内吞途径被巨噬细胞摄取,体内回输的外泌体也可被肝脏原位巨噬细胞摄取;1.4热打击后肝细胞外泌体在体外可激活巨噬细胞向M1表型的转化,在体内回输HS肝细胞外泌体可通过巨噬细胞的M1表型转化诱导肝脏损伤及肝脏炎症。2.热打击后肝细胞释放的外泌体中富含组蛋白,热打击诱导肝细胞内组蛋白核转位并通过结合内体系统上的TLR4受体装配至外泌体2.1通过iTRAQ技术分析,发现热打击显著改变了肝细胞释放外泌体中蛋白质内含物的组成,其中组蛋白H3为高表达前10位的蛋白质,并具有较强疾病相关性,筛选作为目标蛋白;2.2进一步验证了热打击后肝细胞来源的外泌体中组蛋白H3的富集,并与肝细胞损伤的程度呈正相关;2.3热打击后肝细胞外泌体中的组蛋白来源于细胞核,HS后组蛋白先从细胞核转位到细胞浆中,随后没有被降解而是释放到胞外,这一过程不依赖细胞的死亡;2.4胞浆中组蛋白通过结合内体系统上的TLR4受体被转运至MVB中,随后装载到外泌体中而释放;2.5外泌体中的组蛋白H3位于内部。2.6 HS后肝细胞外泌体组蛋白水平升高早于上清中游离态,小鼠HS模型血浆外泌体H3升高也早于游离H3。3.热打击后肝细胞将外泌体中组蛋白H3水平传递给巨噬细胞并通过TLR9受体激活其向M1表型转化3.1 HS肝细胞外泌体可将其内的组蛋白H3传递给巨噬细胞,体内回输的HS肝细胞外泌体中的组蛋白H3也可被肝脏摄取;3.2肝细胞与巨噬细胞间组蛋白的传递是直接通过蛋白传递的方式,而不是通过外泌体传递H3 mRNA或激活巨噬细胞内H3 mRNA转录的方式;3.3 HS肝细胞外泌体在体外促进巨噬细胞向M1表型转化及体内诱导肝损伤及炎症主要通过其内含物组蛋白H3所介导;3.4 HS肝细胞外泌体中组蛋白H3在体外及体内均通过TLR9受体介导促进巨噬细胞向M1表型转化及诱导肝损伤及炎症。4.重症中暑伴肝损伤患者血浆外泌体高表达组蛋白H3,其水平与病情严重程度相关且具有预后评判价值4.1重症中暑合并肝损伤（ALI）的发生率高达45.45%,其中虽大部分为轻度ALI,但严重ALI的发生率也不低,严重ALI的死亡率显著增高,住院时间延长,病情严重程度及合并其他脏器损害的发生率显著增加;4.2重症中暑患者血浆外泌体中组蛋白H3水平存在肝损伤的患者高于无肝损伤患者,重度肝损伤患者又高于轻度肝损伤患者;死亡患者显著高于存活者,且死亡患者随时间升高,而存活者降低;血浆游离组蛋白的变化不如外泌体组蛋白显著;4.3血浆外泌体中组蛋白H3水平与肝损伤评分（MELD）、疾病严重程度评分（APACHE Ⅱ）及器官功能衰竭评分（SOFA）均有显著正相关性;4.4血浆外泌体中组蛋白H3水平诊断重症中暑合并肝损伤或严重肝损伤的ROC曲线下面积高,辨别死亡患者的ROC曲线下面积也高,与传统指标ALT/AST/LDH相仿,且优于血浆游离组蛋白H3。结论1.热打击诱导肝细胞释放大量的外泌体,通过网格蛋白诱导的内吞途径被摄取并促进巨噬细胞向M1表型转化,其作用主要通过富集的内含物组蛋白H3所介导。2.热打击诱导肝细胞内组蛋白核转位到胞浆,通过内体系统上的TLR4受体进入MVB,转运到外泌体中,是不依赖细胞死亡的主动富集过程。3.HS肝细胞外泌体中组蛋白在体外及体内均通过TLR9介导促进巨噬细胞向M1表型转化,诱导肝损伤及炎症。4.重症中暑患者血浆外泌体富含组蛋白H3,是肝损伤潜在的良好预后标记物。