目的青藏高原被誉为“世界屋脊”,是世界上海拔最高、面积最大、形成最晚的高原,具有独特的气候和生态环境。青藏高原上生活着多种野生动物。高寒低氧的自然环境以及丰富的动物资源蕴藏着大量的、原始的、鲜为人知的微生物资源。在本研究中,我们在青藏高原多地采集藏羚羊、岩羊和家养牦牛粪便样本,利用病毒宏基因组学（Viral metagenomics,VM）技术分析肠道病毒组成,对新型小双节RNA病毒（Picobirnavirus,PBV）作了比较深入的研究。方法1.对青藏高原多地采集的藏羚羊、家养牦牛和岩羊粪便样本,提取核酸,质检合格后,进行转录组测序。2.根据转录组测序结果设计特异性巣式RT-PCR引物验证接近全长（大于1500nt）的PBV序列,基于PBV的Rd Rp氨基酸序列构建系统进化树确定分类学地位。3.针对藏羚羊不分节段PBV阳性样本,利用电子显微镜观察PBV的颗粒形态,选取Vero-E6细胞进行病毒的分离培养,利用生物信息学软件预测衣壳蛋白的二级结构、B细胞抗原表位和跨膜结构域。根据预测结果设计截短蛋白进行原核表达,利用目的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在此基础上,建立间接ELISA方法。结果1.藏羚羊肠道病毒转录组测序结果显示:LY-KK和LY-XZ两个病毒文库共检测到773条病毒相关contigs,除去未分类和未知病毒序列,可以注释到砂粒病毒科（Arenaviridae）等27个病毒科。2.家养牦牛肠道病毒转录组测序结果显示:ML-GQ、ML-LB、ML-HX和ML-ZD四个病毒文库共检测到3948条病毒相关contigs,除去未分类和未知病毒序列,可以注释到Alphaflexiviridae（目前该科没有中文名）等29个病毒科。3.岩羊肠道病毒转录组测序结果显示:YY-DL病毒文库共检测到117条病毒相关contigs,除去未分类病毒序列,可以注释到Alphaflexiviridae（目前该科没有中文名）等17个病毒科。4.上述样本共检测到4798条病毒相关contigs,除去未分类和未知病毒序列,可以注释到39个病毒科,其中小双节RNA病毒科（Picobirnaviridae）占比很高,高达79.51%。基于Viral Zone数据库（https://viralzone.expasy.org/664）和在线Blastx比对结果,藏羚羊等牛科动物粪便携带星状病毒（Arenaviridae）等能够感染人的病毒。5.我们利用巣式RT-PCR验证得到32条大于1500nt的新型PBV序列,其中包括一条不分节段PBV。同源性比对发现新型PBV与亲缘关系最近毒株的Rd Rp核苷酸和氨基酸序列一致性分别为26.6%～90.1%和18.0%～93.4%;新型PBV两两比对,结果显示核苷酸和氨基酸序列一致性分别为17.4%～97.7%和11.2%～98.2%。系统进化树表明65.63%（21/32）属于GI。6.针对藏羚羊不分节段PBV样本,利用透射电镜没有观察到PBV存在,选取Vero-E6细胞进行病毒分离培养,没有观察到明显的细胞病变,1-5代细胞收取物PCR检测结果为阴性。根据生物信息学预测结果,我们选取衣壳蛋白N段271AA氨基酸序列进行原核表达,结果显示目的蛋白条带单一,浓度比较理想。以重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,得到效价合格,具有良好反应性和特异性的多克隆抗体。在此基础上,建立间接ELISA检测方法,结果显示抗原包被浓度为3.91μg/m L,一抗和二抗稀释度分别为1:50k和1:5000以及显色时间为10min时是间接ELISA的最佳工作条件。结论1.青藏高原藏羚羊等牛科动物肠道病毒组成丰富,可能携带多种人兽共患性病毒。2.PBVs占比很高,同源性比对与系统进化结果表明PBVs具有高度遗传多样性。3.建立了新型PBV的间接ELISA检测方法,为计划开展的人群血清学筛检奠定了基础。