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第一部分：高通量转录组深度测序分析系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的分子异质性和关键基因功能的初步探索
研究背景:系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种自身免疫性疾病，表现为多个器官及系统受累，其中包括肾脏、皮肤、关节和神经系统等的炎症反应，疾病的活动度随着病情波动而不断变化，同时出现抗核抗体等多种自身抗体。SLE的病因和诱导因素是多种多样的，其中包括遗传因素、环境因素、感染因素以及精神因素等多个方面，其中遗传因素有着重要的作用。而在SLE的治疗过程中，还没有一个特异性治疗方法，只能以缓解病情为目的进行治疗和控制，长期的炎症状态和药物副作用严重影响着患者生活质量。因此针对SLE的发病机制，探索其遗传学病因及功能显得尤为重要。本课题组前期通过外显子芯片研究、基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)在中国汉族人群已经筛选发现多个新的SLE的易感基因及位点，揭示了SLE部分遗传易感机制。而GWAS分析发现的只是基因变异与疾病风险之间一种统计学证据，由于基因组连锁不平衡，所筛选出的易感功能性基因及致病机理大多不明。为了实现从统计学证据到疾病发病机理的跨越，揭示疾病机制，需要开展功能性基因转录组的筛选鉴定以及基因功能探索研究。
研究目的:本研究旨在筛选SLE差异表达的易感基因，初步探索其在疾病中的功能及可能的作用机制。
研究方法:1.在SLE患者及健康对照个体外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中开展高通量RNA-seq测序分析及差异性表达验证;2.利用磁珠分选人PBMC中的CD3+T细胞和CD14+单核细胞，Q-PCR检测并筛选目的基因的表达差异;3.体外实验中，在THP1、U937单核细胞系、PMA诱导U937细胞分化的巨噬细胞中，通过IFN-γ及LPS刺激炎症反应，利用Q-PCR分别检测TCN2基因的转录水平变化。
研究结果:1.RNA-seq测序分析结果发现，与对照组相比，SLE患者PBMC细胞中共筛选出2146个差异基因，其中1040个基因表达上调，1106个基因表达下调，以p＜0.05为差异有统计学意义;设计引物对统计学差异基因较大的20个基因，在SLE和对照组中的表达水平进行Q-PCR验证，结果证实差异基因表达与RNA-seq测序筛查预测结果一致。2.通过检测SLE患者CD3+T细胞和CD14+单核细胞中差异基因表达水平，证实在SLE患者T细胞中IFI6基因表达显著上调，在单核细胞中RNASE1和TCN2表达异常。3.体外实验证实IFN-γ和LPS刺激炎症反应下，可以促进TNC2在单核细胞系和诱导的巨噬细胞中表达上调。
研究结论:在SLE患者PBMC的RNA-seq测序分析中，最终筛查出差异表达的基因2146个，其中上调的有1040个，表达下调的有1106个基因。对20个差异基因的Q-PCR实验验证结果与测序分析结果一致。在CD3+T细胞和CD14+单核细胞中，TCN2基因和RNASE1基因表达差异明显，提示这两个基因可能成为潜在的诊断、判断疾病活动度及预后的分子标志物。TCN2可能成为调节炎症通路关键基因，为SLE治疗和基因组学的功能研究提供了新的潜在靶点。
第二部分：系统性红斑狼疮易感基因HLA-DR3和HLA-DR15与发病风险的关联分析
研究目的:系统性红斑狼疮作为一种遗传性自身免疫病，遗传因素在其发病的过程中占有重要的位置，越来越多的研究表明HLA-DRB1的基因多态性与SLE有着密切的关联性，本研究旨在运用荟萃分析方法综合评估HLA-DRB1基因的两种基因型(HLA-DR3和HLA-DR15)与SLE发病易感性的相关性。
研究方法:截至2018年6月，从PubMed，ElsevierScience，SpringerLink，Medline和Cochrane图书馆数据库中搜索HLA-DRB1和SLE的研究，通过STATA14.0软件建立随机效应模型，利用比值比(OR)与95％置信区间(CI)进行相关性分析。
研究结果:本研究共计纳入23项研究，其中包括5261例SLE病例和9838例对照样本。总体分析显示HLA-DR3和HLA-DR15多态性与SLE疾病易感性存在有较强相关性(OR:1.60，95％CI:1.316-1.934，p=0.129和OR:1.68，95％CI:1.334-2.112，p=0.001)。亚组分析证明了HLA-DR3和HLA-DR15多态性的异质性来源中，种族差异是重要原因之一。白种人与HLA-DR3关联研究中无统计学差异(OR:1.60，95％CI:1.320-1.960，p=0.522)，而东亚人群特异性参与了HLA-DR15与SLE发病异质性的构成(OR:1.65，95％CI:1.248-2.173，p=0.001)。此外，样本人群来源是参与形成HLA-DR3和HLA-DR15多态性异质性的另一个因素。在HLA-DR3的异质性研究中，社区人群的样本来源参与构成异质性(OR:1.65，95％CI:1.37-1.99，p＜0.01)。在HLA-DR15异质性分析中，社区来源的样本以及医院来源的样本都参与构成异质性来源(OR:1.378，95％CI:1.078-1.760，p＜0.01和OR:2.08,95％CI:1.738-2.49,p＜0.01)。
研究结论:HLA-DRB1基因可能是SLE的易感基因，其两个基因型HLA-DR3和HLA-DR15与SLE存在显著相关性。
第三部分：两种单基因遗传性皮肤病家系的基因突变分析:一个掌跖角化症家系基因突变分析研究;一个遗传性反甲伴有白甲家系基因突变分析研究
第一节：一个掌跖角化症家系基因突变分析研究
研究背景:掌跖角化症(palmoplantarkeratoderma，PPK)为一种单基因病，遗传方式以常染色体显性遗传为主，主要表现为掌跖部位皮肤角化过度，角质层增厚，表皮各层增生，根据其临床表型的不同可以分为多种亚型，根据皮损形态可分为点状掌跖角化症、条纹状掌跖角化症、局灶型掌跖角化症，弥漫性掌跖角化症，根据发病特点可以分为单发型或合并其他系统疾病以综合征形式发病，其中综合征，不乏包含有致死性疾病如遗传性大疱性表皮松解症，心肌病等，因此仅仅靠临床表现来精准的判断掌跖角化症的亚型是十分困难的。有文献报道，DSP基因致病突变可以使部分掌跖角化症患者伴有羊毛状卷发，扩张型心肌病、遗传性大疱性表皮松解症、广泛浅表性脓疱病等多种并发症状。DSP基因，编码Desmoplakin蛋白质，参与形成细胞内的细胞骨架接头，功能失调可以导致皮肤增殖紊乱，因此，通过基因检测技术结合其他辅助检查技术，对疾病亚型进行精准的判断，发现并探索致病基因及突变的类型及功能，对于遗传性皮肤病的精准诊疗起到了十分重要的作用。
研究目的:收集一个中国汉族条纹状掌跖角化症家系，对该家系的致病基因、突变及临床表型进行分析，结合皮肤镜、皮肤反射式共聚焦(RCM)检查、组织病理学等多维手段探索掌跖角化症临床表型，以更加精准探讨掌跖角化症致病基因、突变与临床表型的关系，并进行转录组表达探索。
研究方法:(1)采集一个掌跖角化症家系4名成员的外周血，使用Sanger测序的方法对该家系中2名患者进行基因突变检测，以家系中2名健康家系成员和100名无亲缘关系的正常人作为对照(2)通过皮肤镜、RCM以及组织病理学等多种辅助诊断方案进行检查，建立和丰富掌跖角化症多维皮肤影像资源库。
研究结果:(1)该家系中，DSP基因编码区发现一个新的杂合错义突变c.3550C＞T，从而导致色氨酸(Trp，W)突变为精氨酸(Arg，R)，家系中2例正常人和家系以外100例正常人未发现此突变。(2)探索了掌跖角化症从皮肤镜、RCM和组织病理学检查临床表现特点，皮肤镜下可见增厚的角质层成黄色条纹状分布并伴有红色点状血管扩张，RCM显示角质层增厚，颗粒层、棘层细胞增殖，真皮浅层毛细血管扩张，组织病理学显示角化不全，皮突延长，棘细胞间水肿，真皮浅层，淋巴组织细胞浸润。
研究结论:(1)DSP的杂合错义突变c.3550C＞T是导致该家系临床表型的主要原因;(2)掌跖角化在不同检测手段下临床表现各有特点，这些检测可作为其临床分型提供有力证据。
第二节：一个遗传性反甲伴白甲家系基因突变分析研究
研究背景:遗传性白甲伴反甲是一种罕见的指甲营养发育不良，其特征在于指甲板的颜色变白。PLCD1基因的突变已被确定为遗传性白甲(Hereditary leukonychia，HL)的主要致病基因。然而，在中国汉族人群中，相关的报道分析仍然十分少见。
研究目的:本研究旨在探讨中国汉族家系遗传性白甲伴反甲家系病例的典型临床特征及其与PLCD1基因突变的相关性。
研究方法:本研究中，收集了一个遗传性白甲伴反甲的家系，通过采集外周血，并且进行基因组DNA抽提，通过全外显子测序(whole exome sequencing，WES)筛选PLCD1基因的致病突变位点和其他遗传性白甲的候选基因，并进行不同物种PLCD1基因序列保守性进行比对。
研究结果:该家系共有3代，其中3名患者、12名正常家系成员，共采集3例外周血标本，其中患者2例，正常家系成员1例做为对照。患者的临床表型主要为双指(趾)甲板颜色变白，甲远端有粉红色条带，甲中央凹陷边缘翘起，可累及部分或全部甲。在先证者及先证者之母亲外周血中，发现PLCD1基因9号外显子中一个新的杂合子错义突变，c.1451A＞G，这个突变没有在家系其他健康人及100名无亲缘关系对照组人群中检测到，该家系其他成员未检测出PLCD1基因突变。
研究结论:本研究在一个中国汉族遗传性白甲伴反甲家系中检测出PLCD1基因一个杂合错义突变，该错义突变为致病性突变非多态性位点变化，是国内外首次报道的新突变;我们的研究结果丰富了遗传性白甲伴反甲的遗传学突变谱，为将来实现单基因遗传性皮肤疾病的精准诊疗打下基础。
研究背景:系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种自身免疫性疾病，表现为多个器官及系统受累，其中包括肾脏、皮肤、关节和神经系统等的炎症反应，疾病的活动度随着病情波动而不断变化，同时出现抗核抗体等多种自身抗体。SLE的病因和诱导因素是多种多样的，其中包括遗传因素、环境因素、感染因素以及精神因素等多个方面，其中遗传因素有着重要的作用。而在SLE的治疗过程中，还没有一个特异性治疗方法，只能以缓解病情为目的进行治疗和控制，长期的炎症状态和药物副作用严重影响着患者生活质量。因此针对SLE的发病机制，探索其遗传学病因及功能显得尤为重要。本课题组前期通过外显子芯片研究、基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)在中国汉族人群已经筛选发现多个新的SLE的易感基因及位点，揭示了SLE部分遗传易感机制。而GWAS分析发现的只是基因变异与疾病风险之间一种统计学证据，由于基因组连锁不平衡，所筛选出的易感功能性基因及致病机理大多不明。为了实现从统计学证据到疾病发病机理的跨越，揭示疾病机制，需要开展功能性基因转录组的筛选鉴定以及基因功能探索研究。
研究目的:本研究旨在筛选SLE差异表达的易感基因，初步探索其在疾病中的功能及可能的作用机制。
研究方法:1.在SLE患者及健康对照个体外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中开展高通量RNA-seq测序分析及差异性表达验证;2.利用磁珠分选人PBMC中的CD3+T细胞和CD14+单核细胞，Q-PCR检测并筛选目的基因的表达差异;3.体外实验中，在THP1、U937单核细胞系、PMA诱导U937细胞分化的巨噬细胞中，通过IFN-γ及LPS刺激炎症反应，利用Q-PCR分别检测TCN2基因的转录水平变化。
研究结果:1.RNA-seq测序分析结果发现，与对照组相比，SLE患者PBMC细胞中共筛选出2146个差异基因，其中1040个基因表达上调，1106个基因表达下调，以p＜0.05为差异有统计学意义;设计引物对统计学差异基因较大的20个基因，在SLE和对照组中的表达水平进行Q-PCR验证，结果证实差异基因表达与RNA-seq测序筛查预测结果一致。2.通过检测SLE患者CD3+T细胞和CD14+单核细胞中差异基因表达水平，证实在SLE患者T细胞中IFI6基因表达显著上调，在单核细胞中RNASE1和TCN2表达异常。3.体外实验证实IFN-γ和LPS刺激炎症反应下，可以促进TNC2在单核细胞系和诱导的巨噬细胞中表达上调。
研究结论:在SLE患者PBMC的RNA-seq测序分析中，最终筛查出差异表达的基因2146个，其中上调的有1040个，表达下调的有1106个基因。对20个差异基因的Q-PCR实验验证结果与测序分析结果一致。在CD3+T细胞和CD14+单核细胞中，TCN2基因和RNASE1基因表达差异明显，提示这两个基因可能成为潜在的诊断、判断疾病活动度及预后的分子标志物。TCN2可能成为调节炎症通路关键基因，为SLE治疗和基因组学的功能研究提供了新的潜在靶点。
第二部分：系统性红斑狼疮易感基因HLA-DR3和HLA-DR15与发病风险的关联分析
研究目的:系统性红斑狼疮作为一种遗传性自身免疫病，遗传因素在其发病的过程中占有重要的位置，越来越多的研究表明HLA-DRB1的基因多态性与SLE有着密切的关联性，本研究旨在运用荟萃分析方法综合评估HLA-DRB1基因的两种基因型(HLA-DR3和HLA-DR15)与SLE发病易感性的相关性。
研究方法:截至2018年6月，从PubMed，ElsevierScience，SpringerLink，Medline和Cochrane图书馆数据库中搜索HLA-DRB1和SLE的研究，通过STATA14.0软件建立随机效应模型，利用比值比(OR)与95％置信区间(CI)进行相关性分析。
研究结果:本研究共计纳入23项研究，其中包括5261例SLE病例和9838例对照样本。总体分析显示HLA-DR3和HLA-DR15多态性与SLE疾病易感性存在有较强相关性(OR:1.60，95％CI:1.316-1.934，p=0.129和OR:1.68，95％CI:1.334-2.112，p=0.001)。亚组分析证明了HLA-DR3和HLA-DR15多态性的异质性来源中，种族差异是重要原因之一。白种人与HLA-DR3关联研究中无统计学差异(OR:1.60，95％CI:1.320-1.960，p=0.522)，而东亚人群特异性参与了HLA-DR15与SLE发病异质性的构成(OR:1.65，95％CI:1.248-2.173，p=0.001)。此外，样本人群来源是参与形成HLA-DR3和HLA-DR15多态性异质性的另一个因素。在HLA-DR3的异质性研究中，社区人群的样本来源参与构成异质性(OR:1.65，95％CI:1.37-1.99，p＜0.01)。在HLA-DR15异质性分析中，社区来源的样本以及医院来源的样本都参与构成异质性来源(OR:1.378，95％CI:1.078-1.760，p＜0.01和OR:2.08,95％CI:1.738-2.49,p＜0.01)。
研究结论:HLA-DRB1基因可能是SLE的易感基因，其两个基因型HLA-DR3和HLA-DR15与SLE存在显著相关性。
第三部分：两种单基因遗传性皮肤病家系的基因突变分析:一个掌跖角化症家系基因突变分析研究;一个遗传性反甲伴有白甲家系基因突变分析研究
第一节：一个掌跖角化症家系基因突变分析研究
研究背景:掌跖角化症(palmoplantarkeratoderma，PPK)为一种单基因病，遗传方式以常染色体显性遗传为主，主要表现为掌跖部位皮肤角化过度，角质层增厚，表皮各层增生，根据其临床表型的不同可以分为多种亚型，根据皮损形态可分为点状掌跖角化症、条纹状掌跖角化症、局灶型掌跖角化症，弥漫性掌跖角化症，根据发病特点可以分为单发型或合并其他系统疾病以综合征形式发病，其中综合征，不乏包含有致死性疾病如遗传性大疱性表皮松解症，心肌病等，因此仅仅靠临床表现来精准的判断掌跖角化症的亚型是十分困难的。有文献报道，DSP基因致病突变可以使部分掌跖角化症患者伴有羊毛状卷发，扩张型心肌病、遗传性大疱性表皮松解症、广泛浅表性脓疱病等多种并发症状。DSP基因，编码Desmoplakin蛋白质，参与形成细胞内的细胞骨架接头，功能失调可以导致皮肤增殖紊乱，因此，通过基因检测技术结合其他辅助检查技术，对疾病亚型进行精准的判断，发现并探索致病基因及突变的类型及功能，对于遗传性皮肤病的精准诊疗起到了十分重要的作用。
研究目的:收集一个中国汉族条纹状掌跖角化症家系，对该家系的致病基因、突变及临床表型进行分析，结合皮肤镜、皮肤反射式共聚焦(RCM)检查、组织病理学等多维手段探索掌跖角化症临床表型，以更加精准探讨掌跖角化症致病基因、突变与临床表型的关系，并进行转录组表达探索。
研究方法:(1)采集一个掌跖角化症家系4名成员的外周血，使用Sanger测序的方法对该家系中2名患者进行基因突变检测，以家系中2名健康家系成员和100名无亲缘关系的正常人作为对照(2)通过皮肤镜、RCM以及组织病理学等多种辅助诊断方案进行检查，建立和丰富掌跖角化症多维皮肤影像资源库。
研究结果:(1)该家系中，DSP基因编码区发现一个新的杂合错义突变c.3550C＞T，从而导致色氨酸(Trp，W)突变为精氨酸(Arg，R)，家系中2例正常人和家系以外100例正常人未发现此突变。(2)探索了掌跖角化症从皮肤镜、RCM和组织病理学检查临床表现特点，皮肤镜下可见增厚的角质层成黄色条纹状分布并伴有红色点状血管扩张，RCM显示角质层增厚，颗粒层、棘层细胞增殖，真皮浅层毛细血管扩张，组织病理学显示角化不全，皮突延长，棘细胞间水肿，真皮浅层，淋巴组织细胞浸润。
研究结论:(1)DSP的杂合错义突变c.3550C＞T是导致该家系临床表型的主要原因;(2)掌跖角化在不同检测手段下临床表现各有特点，这些检测可作为其临床分型提供有力证据。
第二节：一个遗传性反甲伴白甲家系基因突变分析研究
研究背景:遗传性白甲伴反甲是一种罕见的指甲营养发育不良，其特征在于指甲板的颜色变白。PLCD1基因的突变已被确定为遗传性白甲(Hereditary leukonychia，HL)的主要致病基因。然而，在中国汉族人群中，相关的报道分析仍然十分少见。
研究目的:本研究旨在探讨中国汉族家系遗传性白甲伴反甲家系病例的典型临床特征及其与PLCD1基因突变的相关性。
研究方法:本研究中，收集了一个遗传性白甲伴反甲的家系，通过采集外周血，并且进行基因组DNA抽提，通过全外显子测序(whole exome sequencing，WES)筛选PLCD1基因的致病突变位点和其他遗传性白甲的候选基因，并进行不同物种PLCD1基因序列保守性进行比对。
研究结果:该家系共有3代，其中3名患者、12名正常家系成员，共采集3例外周血标本，其中患者2例，正常家系成员1例做为对照。患者的临床表型主要为双指(趾)甲板颜色变白，甲远端有粉红色条带，甲中央凹陷边缘翘起，可累及部分或全部甲。在先证者及先证者之母亲外周血中，发现PLCD1基因9号外显子中一个新的杂合子错义突变，c.1451A＞G，这个突变没有在家系其他健康人及100名无亲缘关系对照组人群中检测到，该家系其他成员未检测出PLCD1基因突变。
研究结论:本研究在一个中国汉族遗传性白甲伴反甲家系中检测出PLCD1基因一个杂合错义突变，该错义突变为致病性突变非多态性位点变化，是国内外首次报道的新突变;我们的研究结果丰富了遗传性白甲伴反甲的遗传学突变谱，为将来实现单基因遗传性皮肤疾病的精准诊疗打下基础。