【摘 要】
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目的:探讨p32/OPA1轴介导的线粒体动态变化对非小细胞肺癌顺铂（Cisplatin,DDP）化疗敏感性和耐药性的影响及其相关机制。方法:1、Western Blot检测非小细胞肺癌细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中p32及线粒体动态相关蛋白的表达水平;激光共聚焦显微镜观察转染p Ds Red-Mito质粒后细胞中线粒体形态差异;利用ATP试剂盒检测细胞内ATP水平差异。从而初步探
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目的:探讨p32/OPA1轴介导的线粒体动态变化对非小细胞肺癌顺铂（Cisplatin,DDP）化疗敏感性和耐药性的影响及其相关机制。方法:1、Western Blot检测非小细胞肺癌细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中p32及线粒体动态相关蛋白的表达水平;激光共聚焦显微镜观察转染p Ds Red-Mito质粒后细胞中线粒体形态差异;利用ATP试剂盒检测细胞内ATP水平差异。从而初步探索p32蛋白表达和线粒体动态与非小细胞肺癌顺铂耐药是否存在相关性。2、为模拟非小细胞肺癌顺铂耐药,对非小细胞肺癌A549和H460细胞进行顺铂压力刺激实验,Western Blot检测p32与线粒体动态相关蛋白的表达变化。3、为了进一步探索p32对线粒体形态的调控机制,利用si RNA敲低A549/DDP中p32蛋白的表达水平,Western Blot检测线粒体分裂蛋白Drp1及线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达;激光共聚焦显微镜观察线粒体形态;利用ATP试剂盒检测细胞内ATP水平。4、为确定p32与OPA1的上下游关系,利用si RNA敲低A549/DDP中OPA1蛋白的表达水平,Western Blot检测A549/DDP中p32蛋白的表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖活性:阴性对照组（NC）,DDP处理组,OPA1敲低组和OPA1敲低+DDP处理组。5、在顺铂耐药A549/DDP细胞中设置阴性对照组（NC）,DDP处理组,p32敲低组和p32敲低+DDP处理组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性;通过流式仪检测细胞凋亡情况。6、利用二甲双胍（Metformin;Met）验证上述分子机制。用p32激酶激活剂（D-erythro-Sphingosine;Sph）激活p32,实验分为三组:Con组;Met处理组;Met+Sph处理组。Western Blot检测其下游OPA1的蛋白表达水平,共聚焦显微镜观察线粒体形态变化。结果:1、与非小细胞肺癌A549相比,顺铂耐药A549/DDP细胞中p32以及线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的蛋白水平明显升高,而线粒体分裂蛋白Drp1的表达水平显著降低;A549/DDP细胞内线粒体融合增加,线粒体平均长度比A549细胞长;A549/DDP细胞内的ATP水平高于A549细胞。2、对非小细胞肺癌A549细胞和H460细胞进行顺铂压力刺激第6天后,p32与OPA1的蛋白水平均显著升高。3、在A549/DDP细胞中敲低p32蛋白表达后,OPA1表达降低,线粒分裂增加,细胞内ATP水平降低。4、在A549/DDP细胞中敲低OPA1后,p32蛋白表达水平不变。与DDP处理组和OPA1敲低组相比,OPA1敲低+DDP处理组的细胞增殖活性显著降低。5、与DDP处理组和p32敲低组相比,敲低p32+DDP处理组的细胞增殖活性显著降低,细胞凋亡率明显增加。6、二甲双胍处理A549/DDP细胞后,p32、OPA1蛋白表达水平降低,线粒体分裂增加;而加入p32激酶激活剂后OPA1蛋白表达升高,线粒体融合水平增加。结论:1、p32蛋白表达与线粒体融合增加可能与非小细胞肺癌顺铂耐药机制有关。2、敲低p32后可以通过下调OPA1表达抑制线粒体融合,增加非小细胞肺癌细胞对顺铂的化疗敏感性。3、二甲双胍可以通过p32/OPA1轴介导线粒体分裂,增加非小细胞肺癌细胞对顺铂的化疗敏感性。
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