氯离子通道是一种重要的阴离子通道,与恶性肿瘤的发生发展过程密切相关。恶性肿瘤为肿瘤类干细胞,其中干性基因呈现高表达状态。Sox2作为恶性肿瘤细胞关键的干性基因之一,除了具有维持细胞自我更新和多向分化的潜能外,其异常表达可能促进多种恶性肿瘤的发生和进展。本研究中,我们通过加入氯通道阻断剂DIDS(4,4’-Diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid)滞氯通道的表达发现:抑制氯通道可导致前列腺癌DU145、PC3细胞的增殖受到抑制,且对人体正常成纤维细胞无明显作用,而经过Q-PCR检测我们发现氯通道异常表达于肿瘤细胞中,与许多文献报道相符。提示我们这一靶向性可能与氯通道的异常表达有关。随后下调氯通道蛋白的表达发现,细胞增殖受到抑制,且细胞阻滞在了G0/G1期,其调控周期途径是通过cyclin D1蛋白表达下调,p27表达上调。然而,关于氯通道调控细胞周期的具体靶点尚未报道。随后我们应用了基因芯片技术筛选出的Sox2基因在阻滞氯通道的前列腺癌细胞DU145中变化最为明显,提示Sox2可能是氯通道调控周期的关键所在,应用RNAi下调Sox2后,验证了Sox2亦是通过Cyclin D1和p27来调控前列腺癌细胞周期,与氯通道阻滞后的细胞周期变化相符。而氯通道与Sox2之间的关系也未见报道,然后通过激光共聚焦发现分别下调氯通道与Sox2的表达,下调氯通道的表达,Sox2的表达亦下调,下调Sox2的表达,氯通道的表达也随之下调。我们进一步通过免疫共沉淀(IP)实验,沉淀氯通道蛋白时可以沉淀Sox2蛋白,而沉淀Sox2时,氯通道蛋白也会随之沉淀下来。提示氯通道蛋白与Sox2蛋白存在密切的相关作用。上述细胞学结果在动物体内得到了验证,在接种DU145细胞4周后,采用腹腔给药DIDS发现:给药组的肿瘤体积明显小于Control组,且免疫组化切片表示:给药组的氯通道蛋白、Sox2、ki67、cyclin D1表达量均比control组低。总的来说,我们实验证实了阻滞氯通道是通过调控cyclin D1蛋白、p27周期蛋白使DU145细胞阻滞在G0/G1期来抑制前列腺癌细胞的增殖,Sox2参与其调控途径,且首次证实氯通道蛋白与Sox2具有直接的相互作用。方法和结果:1.氯通道阻断剂DIDS抑制前列腺癌细胞系的增殖与周期有关。(1)氯通道阻断剂DIDS不同程度抑制前列腺癌细胞的增殖方法:培养人前列腺癌细胞系DU145、PC3及人正常成纤维细胞HFF-1;四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)分析法分别检测加入DIDS后细胞生存率。结果:我们发现DIDS可抑制前列腺癌细胞系DU145、PC3细胞的生长。且呈一定浓度和时间依耐性,其中对DU145细胞的抑制作用更为明显。对人正常成纤维细胞抑制作用不显著。(2)氯通道阻断剂阻滞前列腺癌细胞DU145的细胞周期方法:PI染色测细胞周期,分别检测0、24、48小时加入DIDS后的DU145细胞的周期。结果:流式细胞技术分析DIDS(100μmol/L)对于DU145细胞周期的影响,0h细胞大多数处于G1期,随后24h、48h处于G1期的细胞数量增加,G2期与S期的细胞数量减少,统计结果表示在加入DIDS后细胞被阻滞在G0/G1期。2.氯通道蛋白异常表达于肿瘤细胞中,氯通道蛋白CLIC3、CLIC2参与细胞周期调控。(1)氯通道蛋白异常表达于肿瘤细胞中方法:实时定量PCR分别检测人前列腺癌细胞DU145、人正常成纤维细胞中氯通道家族蛋白的表达情况。结果:前列腺癌DU145细胞中氯通道蛋白CLIC3、CLIC2异常表达。提示我们氯通道的异常表达可能是其生长的关键所在。降低氯通道过表达对于肿瘤的治疗具有重大意义。(2)氯通道蛋白CLIC3、CLIC2参与细胞周期调控。方法:分别干扰氯通道蛋白CLIC3、CLIC2的表达后,采用流式细胞术检测其周期的变化。结果:相比于空白对照组而言,下调CLIC2、CLIC3后,细胞的G1期所占的比例增加,S期减少。与使用氯通道阻断剂DIDS处理后的细胞周期相符。明确了氯通道蛋白CLIC3、CLIC2参与了DU145细胞周期的调控。3.干性基因Sox2参与周期的调控(1)基因芯片技术筛选出DIDS处理24h、48h后的DU145细胞。方法:高通量筛选DIDS处理后的DU145细胞,并统计变化最为明显的相关基因组。结果:在变化的系列基因组中,干性基因组变化最为明显,于是我们统计了所以变化的干性基因,整理成基因变化倍数图,发现Sox2基因变化最为明显,猜测Sox2基因可能在周期调控中处于关键位置。(2)验证筛选出的Sox2干性基因与氯通道阻滞有关。方法:将DU145细胞种于2个6孔板中,用DIDS(100μM)处理细胞DU145,分别在12h、24h和48h收蛋白,western blot检测蛋白Sox2。结果:相比空白对照组,12h的Sox2蛋白变化不大,随着时间的增加,24h、48h相比空白组Sox2的减少更为明显。与基因芯片的结果相呼应。4.氯通道蛋白CLIC2、CLIC3与干性基因Sox2的相关性分析(1)免疫共沉淀法检测这几种蛋白在体内是否有相互作用。方法:采用A/G珠子免疫共沉淀观察氯通道蛋白CLIC2、CLIC3与干性基因Sox2的相关性。结果:沉淀Sox2时,input阳性组有蛋白沉淀下来,IP实验组CILC2、CLIC3都有沉淀下来,且阴性对照组Ig G组没有蛋白的表达。相反,沉淀CLIC2时,input阳性组有蛋白沉淀下来,IP实验组Sox2沉淀下来,且阴性对照组Ig G组没有蛋白的表达。沉淀CLIC3时,input阳性组有蛋白沉淀下来,IP实验组Sox2沉淀下来,且阴性对照组Ig G组没有蛋白的表达。正反2方面验证了Sox2与CLIC2、CLIC3在体内有直接的相互关系。(2)免疫荧光检测体外蛋白相互作用情况。方法:将前列腺癌DU145种在细胞爬片上,其中分为4组,一组空白对照组,一组干扰Sox2组,而另一组为干扰CLIC2组,一组为干扰CLIC3组。荧光二抗孵育后,DAPI染色。激光共聚焦显微镜(Olympus)下观察。结果:下调CLIC2组的CLIC2荧光强度比对照组明显降低,Sox2的荧光强度比对照组明显降低;下调Sox2组的Sox2荧光强度比对照组弱,CLIC2的荧光强度比对照组弱。下调CLIC3组的CLIC3荧光强度比对照组明显降低,Sox2的荧光强度比对照组明显降低;下调Sox2组的Sox2荧光强度比对照组弱,CLIC3的荧光强度比对照组弱。由此可知Sox2与氯通道蛋白CLIC2、CLIC3呈正相关。5.氯通道阻断剂DIDS及Sox2参与周期调控的可能机制,及非雄激素依赖型前列腺癌的转归。(1)氯通道阻断剂DIDS处理DU145细胞后其G1周期蛋白的变化方法:使用氯通道阻断剂DIDS(100μM)处理细胞24h、48h后,收蛋白后,western blot检测周期蛋白p27、p16、p53和cyclin D1的变化。结果:Cyclin D1实验组随着时间的增加持续下调,p27与对照组相比在24h、48h有所增加,p53和p16变化并不明显。Cyclin D1与细胞周期的G1期密切相关,可促进G1期细胞转向S期,p27是一种属于细胞周期素依赖激酶的抑制物之一,可以抑制细胞周期G1的期形成。因此Cyclin D1的减少与P27表达量的增加均能将细胞阻滞在G1期,上述的流式结果相一致。(2)干扰Sox2,检测DU145细胞G1周期蛋白的变化方法:采用脂质体转染003号转染试剂后,使用western blot检测周期蛋白p27和cyclin D1的变化。结果:下调Sox2后,与对照组相比,Sox2的表达明显受到抑制,Cyclin D1下调,p27上调。灰度统计图也表明具有统计学差异(p<0.05)。与氯通道阻断剂DIDS阻滞周期后,周期蛋白的变化一致。(3)氯通道阻滞后DU145细胞恶性指标变化。方法:DIDS(100μM)处理DU145细胞24h、48h后收取蛋白,western blot检测雄激素受体AR的蛋白变化及前列腺癌特异性抗原PSA的变化。结果:24h、48h组的AR蛋白变化与空白组相比没有明显差异,而前列腺癌特异性抗原PSA在48h变化明显,与空白组相比明显降低。表明其恶性程度明显下调。6.体内实验验证抑制氯通道可阻滞肿瘤的发展及Sox2的关系。(1)氯通道阻断剂DIDS腹腔注射后对接种的前列腺癌肿瘤体积的影响方法:使用1mL的注射器注射DU145细胞悬液100μl(约1*107个细胞)于BALB/c-nu裸鼠(雄性、周龄3-4周、质量10g)皮下注射,1周后裸鼠右后肢出现圆形隆起,每隔3天记录裸鼠种植瘤的长和宽,计算肿瘤体积=(长*宽*宽)/2,开始连续给药1周。在实验过程中,我们平行观察了动物的行为学和体重,都没有发现明显副作用,停药后继续观察至两周,处死。剥离出接种的肿瘤,拍照并统计其体积的变化。结果:在种瘤1周后,各裸鼠均长出圆形隆起且质地坚硬,连续给药7天后,停止给药发现:高剂量组的肿瘤体积明显与control组和低剂量组具有差异。统计图表示:DIDS高剂量组的肿瘤体积维持在0.15(cm3)左右,而contol组和低剂量组则高达0.45(cm3)和0.40(cm3),具有显著性差异。表明腹腔注射DIDS对前列腺癌肿瘤的生长具有阻滞作用。(2)肿瘤组织切片免疫组化验证氯通道阻断剂DIDS阻滞周期的作用,并体内验证Sox2与氯通道蛋白是否存在相关性。方法:将肿瘤组织使用4%多聚甲醛固定一周后,包埋石蜡,切片染色。在显微镜下观察目的蛋白P27、cyclin D1、Ki67、Sox2与空白对照组之间的差异。结果:图中蓝色代表细胞核,棕色代表目的蛋白,DIDS高剂量组明显下调了Ki-67、Cyclin D1、Sox2的表达,上调了P27的表达,使用IPP灰度扫描软件分析了切片结果,高剂量组的Ki-67、Cyclin D1、Sox2下调明显与control具有统计学差异,P27上调明显与control组具有统计学差异。这一结果与上述细胞学实验相互辉映。结论:1)DIDS可呈一定浓度和时间依耐性的抑制前列腺癌细胞系DU145、PC3细胞的生长。其中对DU145细胞的抑制作用更为明显。对人正常成纤维细胞抑制作用不显著。DIDS是通过阻滞其在G0/G1期来抑制前列腺癌细胞系的生长;2)前列腺癌DU145细胞中氯通道蛋白CLIC3、CLIC2异常表达,并参与了DU145细胞周期的调控。是氯通道阻断剂DIDS阻滞细胞周期的可能性机制;3)基因芯片高通量筛选出的干性基因Sox2确实参与了DU145细胞周期的调控;4)细胞内细胞外实验证实氯通道蛋白CLIC2、CLIC3与干性基因Sox2存在直接的相互关系,氯通道蛋白可能成为调控干性基因Sox2的一个潜在靶点;5)氯通道阻断剂DIDS是通过上调p27、下调周期蛋白cyclin D1来调控细胞周期,Sox2参与其中。其阻滞细胞周期后雄激素受体变化不明显,但前列腺癌特异性抗原PSA明显降低,使肿瘤恶性程度下调;6)动物实验验证阻滞氯通道是通过调控cyclin D1蛋白、p27周期蛋白使前列腺癌肿瘤阻滞在G0/G1期,干性基因Sox2明显下调,提示氯通道蛋白可能成为调控干性基因的一个潜在靶点。