论文部分内容阅读
目的： 探讨天冬脱蛋白多糖对体外培养的人正常肝细胞株7702和肝癌细胞株Hep3B、HepG2生长的影响及其作用机理。 方法： 冷水浸提、乙醇沉淀法提取天冬粗多糖，再用链菌蛋白酶E及Sevag法脱蛋白，最后用纤维素及琼脂糖凝胶层析柱纯化提取高纯度的脱蛋白天冬多糖，并对其进行鉴定及分子量检测。以对应培养基为空白对照、丝裂霉素为阳性对照，用MTT法检测不同浓度天冬多糖在不同作用时间下对体外培养的人正常肝细胞株7702和肝癌细胞株Hep3B、HepG2生长的影响，绘制量效曲线及生长曲线并计算IC50值；光镜观察药物作用下的细胞形态变化差异，了解细胞凋亡情况：流式细胞技术检测药物处理48h后的肝癌细胞调亡情况及周期变化；半定量RT-PCR检测细胞凋亡相关基因bax、bcl-2、Caspases-3的表达差异。 结果： 1.使用本提取方法所得的提取物为脱蛋白天冬多糖，分子量约在5500-400000，且不含蛋白质、单糖等成分，性状稳定，纯度高。 2.脱蛋白天冬多糖对人正常肝细胞株7702的生长有双向调节作用：中低浓度(5、10mg/ml)时有一定的促进作用，浓度较大(25mg/ml)时表现出一定的抑制作用，随着浓度的增加，其抑制作用明显(P<0.05)；对人肝癌细胞株Hep3B、HepG2的生长则表现出一定的抑制作用，随着浓度的增加，其抑制作用更为显著(P<0.01)。天冬多糖与丝裂霉素联合用药实验结果表明：联合用药对7702、Hep3B和HepG2细胞生长的影响均表现出比单独使用丝裂霉素更好的抑制作用，随着浓度的增加，其抑制作用更为明显(P<0.01)。 3.光镜下可观察到天冬多糖处理48h后的肝癌细胞Hep3B、HepG2出现细胞减少、细胞皱缩、体积变小、变形，胞质内空泡形成等凋亡细胞的一些形态学特征。 4.流式细胞仪检测药物处理48h后肝癌细胞Hep3B、HepG2的细胞凋亡结果可见较为典型的亚二倍体峰，Hep3B、HepG2细胞的凋亡数量随着天冬多糖浓度的升高呈现上升趋势。天冬多糖10mg/mL和25mg/mL两个浓度组与空白对照组比较Hep3B、HepG2细胞凋亡数量增加(P<0.05)。 5.流式细胞仪检测药物处理48h后的肝癌细胞Hep3B的细胞周期结果提示天冬多糖诱导肝癌细胞Hep3B凋亡的机制之一主要是通过：在中低浓度(5mg/ml、10mg/ml)时将细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期(P<0.01)，高浓度(25mg/ml)时将细胞阻滞在细胞周期的G2/M期来实现的(P<0.01)，同时在各浓度作用下均伴随S期细胞阻滞(P<0.01)。 流式细胞仪检测药物处理48h后的肝癌细胞HepG2的细胞周期结果提示天冬多糖诱导肝癌细胞HepG2凋亡的机制之一主要是通过将细胞阻滞在细胞周期的G2/M期来实现的(P<0.05)，同时在中低浓度(5mg/ml、10mg/ml)时伴随着S期细胞的阻滞(P<0.01)。 6.半定量RT-PCR结果显示各天冬多糖组下调人肝癌细胞Hep3B的bcl-2mRNA表达，与空白对照组及丝裂霉素阳性对照组比较有明显差异(P<0.01)；上调人肝癌细胞Hep3B的baxmRNA表达，与空白对照组及丝裂霉素阳性对照组比较有差异(P<0.05)；上调人肝癌细胞Hep3B的csapase-3mRNA表达，中高浓度(10mg/ml、25mg/ml)组与空白对照组及丝裂霉素阳性对照组比较差异显著(P<0.01)。各天冬多糖组对人肝癌细胞的HepG2的bax、caspase-3mRNA具有上调趋势，对bcl-2mRNA则表现为下调趋势，且随着浓度的增加趋势越明显(P<0.01)。 结论： 1.本实验提取、分离、纯化天冬脱蛋白多糖的方法可靠，分子量约在5500-400000范围，该纯化天冬多糖不含蛋白质、脂类及单糖等成分。 2.在体外培养情况下，天冬多糖脱蛋白对人肝细胞株7702的生长具有双向调节作用；低浓度时(<10mg/ml)具有一定的促进作用，而当浓度较大时(>10mg/ml)时则表现出一定的抑制作用，并随着浓度的增加和时间的延长，其抑制作用更为明显。 3.在体外培养情况下，脱蛋白天冬多糖对人肝癌细胞株Hep3B、HepG2的生长则表现出一定的抑制作用，并随着浓度的增加，其抑制作用更为明显。 4.脱蛋白天冬多糖体外抗肝癌的机制可能主要是：通过上调bax、caspase-3及下调bcl-2基因水平，将Hep3B细胞周期在中低浓度(5mg/ml、10mg/ml)时阻滞在G0/G1期，高浓度(25mg/ml)时将细胞阻滞在细胞周期的G2/M期，与此同时伴随着S期细胞阻滞来实现的；将HepG2细胞阻滞在细胞周期的G2/M期及在中低浓度(5mg/ml、10mg/ml)时伴随着S期细胞的阻滞来实现的。