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【目的】半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase）包含caspase-1、caspase-4和caspase-11等,各种原因导致细胞内炎症小体活化,活化后的caspase剪切Gasdermin-D蛋白（GSDMD）的C端和N端结构域的连接区,释放N端（GSDMD-N）,该结构域可以结合膜磷脂并在膜上打孔破坏细胞膜,分泌白细胞介素1β（interleukin 1β,IL-1β）、白细胞介素18（interleukin18,IL-18）诱导细胞焦亡,进而发生一系列组织炎症损伤,这是炎症病理的特征性病变。实体器官移植中,移植物经过获取、冷保存、移植等过程,会出现缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）;受体的免疫系统激活和多种炎症因子的释放,亦可加重移植物的损伤,在这些病理损伤中,细胞焦亡是一种常见的病理改变。干扰素调节因子（Interferon regulatory factor,IRF）家族成员包含IRF1、IRF2和IRF4等。IRF1和IRF4等已相继被证实参与了部分免疫细胞的分化、发育等过程,在IRF2基因敲除（IRF2-Knockout,IRF2-KO）的巨噬细胞/内皮细胞中,GSDMD的总蛋白表达受到抑制,而以上两种细胞在肝脏中广泛分布。因此,研究者推测:IRF2可能减轻肝脏缺血再灌注损伤（Liver ischemia-reperfusion injury,LIRI）。本研究通过抑制IRF2的表达,探索其对细胞焦亡的影响,并进一步研究IRF2-KO对LIRI的影响及相关机制。【方法】本研究分为两部分:第一,下调IRF2表达能否改善肝脏缺血再灌注损伤;第二,IRF2-KO影响LIRI的可能机制。第一部分在体内中研究下调IRF2表达能否改善LIRI:将小鼠分为3组:I/R组,野生型（Wild type,WT）C57BL/6J小鼠建立LIRI模型;KO+I/R组,IRF2-KO（IRF2-/-）小鼠建立小鼠LIRI模型;假手术组（Sham组）,WT小鼠不进行LIRI处理,其余手术过程同上述两组。对I/R组及KO+I/R组小鼠肝脏进行热缺血再灌注处理,缺血时间为1h,再灌注6h后收集小鼠血清,检测血清中谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）含量。收集各组建模后小鼠的肝脏组织,进行苏木素-伊红（Hematoxylineosin staining,HE）染色,对肝脏进行病理损伤评分（Suzuki评分）,脱氧核苷酸末端转移酶介导的d UTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）染色,观察各组肝脏细胞焦亡及炎性浸润情况;使用蛋白质印迹法（Western blot,WB）帮助分析GSDMD-N蛋白的表达水平。第二部分进行体内和体外实验观察、分析IRF2-KO影响LIRI的可能机制。1、体内实验:观察Kupffer细胞对LIRI的影响。给受试小鼠转输WT小鼠肝巨噬细胞（Kupffer细胞）（Macrophages,M?）。将小鼠分为3组,分别为:KO+M?+I/R组,IRF2-KO小鼠在转输WT小鼠Kupffer细胞后再进行LIRI;KO+I/R组,给IRF2-KO小鼠输注与m?同等体积的PBS溶液,再进行LIRI;I/R组,同上一组处理WT小鼠。检测血清中ALT和AST含量。收集各组建模后小鼠的肝脏组织,进行HE染色及病理评分,TUNEL染色和MPO染色,观察各组肝组织损伤情况。2、体外实验:2.1应用si RNA在体外下调IRF2,观察对骨髓来源巨噬细胞（Bone marrowderived macrophages,BMDM）焦亡的影响。前期实验提取正常WT C57BL/6J小鼠BMDM。成功培养出原代巨噬细胞后,使用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）及腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）刺激原代巨噬细胞构建出细胞焦亡模型。制备IRF2小干扰RNA（（Small interfering Ribonucleic Acid,si RNA）-IRF2）,对巨噬细胞进行转染以降低IRF2的表达。将实验分为4组,分别为:Control组、LPS+ATP组、LPS+ATP+阴性对照si RNA（si RNA-Negative Control,si RNA-NC）组、LPS+ATP+si RNA-IRF2组。进行相应处理后收集其细胞上清,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测其中IL-1β和IL-18等炎症因子的释放水平。提取细胞蛋白通过Western blot检测细胞GSDMD、caspase 1的前体（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1,procaspase1）、caspase 1的剪切体（cleaved caspase 1,c-caspase1）、caspase 11的前体（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 11,pro-caspase11）、caspase 11的剪切体（cleaved caspase 11,c-caspase11）的蛋白表达情况。2.2体内敲除IRF2,观察对BMDM细胞焦亡的影响。提取WT C57BL/6J小鼠和IRF2-/-C57BL/6J小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞,分为Control组、LPS+ATP组和LPS+ATP+IRF2-/-组。经相应处理后,对上述体外实验进行验证,并在电镜下观察各组细胞膜孔道变化,判断细胞焦亡情况。【结果】第一部分:I/R组小鼠相对Sham组小鼠,血清ALT和AST明显升高（ALT:P＜0.001;AST:P＜0.001）,HE染色提示肝脏大面积坏死;肝脏MPO染色提示肝组织中性粒细胞浸润明显增加（P＜0.05）,TUNEL染色阳性细胞数比例明显增加（P＜0.05）;肝脏内GSDMD-N蛋白表达明显增高。KO+I/R组与I/R组相比,血清ALT和AST明显降低（ALT:P＜0.01;AST:P＜0.05）;HE染色病理提示肝组织结构较为完整,坏死面积明显减少,Suzuki评分明显下降（P＜0.01）,肝脏MPO染色提示肝组织中性粒细胞浸润明显减轻（P＜0.05）,TUNEL染色阳性细胞数比例明显减少（P＜0.05）;肝脏内GSDMD-N蛋白表达明显下降。以上结果提示敲除IRF2可以明显减轻LIRI损伤,同时肝脏中细胞焦亡减少。第二部分:1.体内实验:KO+M?+I/R组与KO+I/R组相比,血清ALT和AST水平明显升高（ALT:P＜0.0001;AST:P＜0.001）,HE染色病理提示小鼠肝脏大面积坏死,Suzuki评分明显升高（P＜0.01）,肝脏MPO染色炎性细胞浸润明显增加（P＜0.01）,TUNEL染色阳性细胞数比例明显增多（P＜0.05）;与I/R组相比,血清ALT水平升高（P＜0.01）,血清ASTS水平、肝脏病理评分、MPO及TUNEL染色结果相比统计学无明显差异。以上结果提示IRF2-KO小鼠转输WT小鼠来源kupffer细胞之后加重LIRI。2.体外实验:用si RNA抑制IRF2表达后,LPS+ATP+si RNA-IRF2组和LPS+ATP组相比细胞上清中IL-1β和IL-18的分泌减少（IL-1β:P＜0.05;IL-18:P＜0.001）,Western blot提示GSDMD-N表达降低;LPS+ATP+si RNA-NC组和LPS+ATP组相比,细胞上清中IL-18分泌减少（P＜0.05）,细胞上清中IL-1β则无统计学差异,细胞中GSDMD-N蛋白表达也无明显差异。直接敲除细胞中IRF2后,LPS+ATP+IRF2-/-组相对LPS+ATP组,焦亡经典通路及非经典通路中的重要蛋白GSDMD-N、C-caspase1、C-caspase11表达都明显降低,ELISA检测IL-1β和IL-18的分泌也减少（IL-1β:P＜0.01;IL-18:P＜0.01）;并且电镜下显示LPS+ATP+IRF2-/-组相对LPS+ATP组细胞形态较为正常,细胞膜孔道明显减少。【结论】1、下调IRF2可以减轻BMDM细胞焦亡;2、敲除IRF2可减轻LIRI;3、敲除IRF2对LIRI的保护作用可被Kupffer细胞部分逆转,提示:下调IRF2可能通过减少Kupffer细胞焦亡减轻LIRI。