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目的：观察黄菟益肾方对C-BSA特发性膜性肾病大鼠的生化指标(24h-PRO、TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr)，肾脏病理及自噬、凋亡相关蛋白(p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9)和mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达的影响，探讨黄菟益肾方对C-BSA特发性膜性肾病大鼠的干预效果及作用机制，为临床应用黄菟益肾方治疗特发性膜性肾病提供实验依据。
方法：110只SPF级雄性SD大鼠随机抽取15只做为正常组(NG)。剩余95只采用C-BSA造模法制备特发性膜性肾病大鼠模型。造模成功后的大鼠随机分为6组：模型组(MG)、黄菟益肾方大剂量组(ZHG)，黄菟益肾方中剂量组(ZMG)、黄菟益肾方小剂量组(ZLG)，雷帕霉素组(RG)、贝那普利组(BG)。共给药干预4W。定期观察大鼠一般状态。2W末时，各组分别处死5只大鼠，余大鼠4W末处死。检测24h尿蛋白定量(24h-PRO)，血清生化指标(TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr)；光镜观察肾脏病理(Masson、PASM染色)；透射电镜观察肾小球超微结构、基底膜变化；免疫组化法检测肾组织Podocin、WT1蛋白表达。4W末时另用WesternBlot和Real-timePCR检测肾组织p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白和mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达。
结果：
1.黄菟益肾方对C-BSA大鼠一般状态的影响
NG大鼠精神状态佳，活泼好动。MG大鼠精神萎靡，消瘦明显，饮食及进水量、尿量明显减少，四肢、头面部肿胀，毛发暗黄无光泽。ZHG、ZMG、ZLG大鼠精神状态好转，饮食进水无异常，体重稍有降低，ZHG大鼠用药后尿量增多。RG大鼠治疗2W时精神好，毛色正常，活泼好动，但3W时活动量减少，多数大鼠逐渐消瘦。BG大鼠精神尚可，进水饮食正常，但大鼠懒动不活跃。
2.黄菟益肾方对C-BSA大鼠24h-PRO和血清生化指标的影响
与同时间点NG组比较，MG大鼠24h-PRO显著增加(p＜0.01)，TP、ALB显著下降(p＜0.01)，TC、TG升高显著(p＜0.01)，大鼠出现了肾病综合征，提示造模成功。BUN、Scr与NG无明显差异(p＞0.05)。治疗2W后，与同时间点MG比较，各治疗组大鼠的24h-PRO，TP、ALB均有不同程度的改善，但无统计学意义(p＞0.05)，各治疗组(除RG外)TC、TG均有不同程度的下降，RG组TC、TG稍有升高，但差异均不显著(p＞0.05)。治疗4W后，与同时间点MG相比，各治疗组24h-PRO显著减少(p＜0.01)，TP、ALB明显升高(p＜0.01)，ZHG、ZMG、ZLG、BG组TC、TG降低明显(p＜0.01或p＜0.05)，RG组TC、TG升高明显(p＜0.05)。各治疗组间24h-PRO、TC、TG降低，TP、ALB升高均以ZMG最为显著(p＜0.01或p＜0.05)。与2W末同组相比，除ZHG外，各治疗组24h-PRO均明显下降，TP、ALB升高显著(p＜0.01或p＜0.05)；ZMG、ZLG组TC、TG明显下降(p＜0.01或p＜0.05)，RG组TC、TG显著升高(p＜0.01)；上述指标尤以ZMG改善更为显著(p＜0.01)。
3.黄菟益肾方对C-BSA大鼠肾组织病理的影响
光镜下可见：NG大鼠肾小球正常，MG大鼠2W时可见嗜复红蛋白沉积于上皮细胞下，GBM增厚，肾小管上皮细胞可见空泡样改变；4W时肾小球病变较2W加重，基底膜进一步增厚，上皮下嗜复红蛋白沉积增多，并出现肾小球毛细血管襻狭窄、闭塞，系膜基质增多，不同程度的肾小管萎缩，肾间质炎性细胞浸润及肾小球硬化。各治疗组治疗2W时可见肾小球GBM增厚、嗜复红蛋白在上皮细胞下沉积，系膜区增生；但较MG减轻；治疗4W后，各治疗组肾脏损伤均较MG有不同程度的改善，尤其ZMG最为明显。
透射电镜下可见：NG大鼠GBM无增厚，未见电子致密物沉积，足突排列整齐、间隙均匀，足突端无融合、膨大。治疗2W后MG大鼠电镜下可见GBM弥漫性增厚，电子致密物沉积，足突膨大肿胀、融合形成钉突，足突间隙大小不等；各治疗组不同程度的GBM增厚，电子致密物沉积，足突膨大肿胀、融合，间隙大小不等，但较MG程度减轻。治疗4W后，各治疗组GBM增厚、电子致密物沉积及足细胞损伤情况均较MG有不同程度的改善，尤以ZMG改善最明显。
4.黄菟益肾方对C-BSA大鼠足细胞Podocin、WT1蛋白表达的影响
免疫组化法检测各组大鼠肾脏Podocin、WT1蛋白的表达，结果显示：与同时间点NG组比较，MG组Podocin、WT1蛋白表达下降(p＜0.01)，C-BSA大鼠出现了明显的足细胞损伤。治疗2W后，与同时间点MG相比，各治疗组Podocin、WT1蛋白表达稍有升高，但无统计学意义(p＞0.05)。治疗4W后，与同时间点MG相比,各治疗组Podocin、WT1蛋白表达显著升高(p＜0.01或p＜0.05)，各治疗组间以ZMG、RG升高最为显著(p＜0.01或p＜0.05)。与2W末同组相比，各治疗组除ZHG外Podocin、WT1蛋白表达均明显升高(p＜0.01或p＜0.05)；其中ZMG、RG升高最为显著(p＜0.01)。
5.黄菟益肾方对C-BSA大鼠p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达的影响
Westernblot与Real-timePCR结果显示：与NG相比，MG大鼠p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达显著上调(p＜0.01)。与MG相比，各治疗组上述蛋白和mRNA表达均明显下调(p＜0.01或p＜0.05)。各治疗组相比，ZMG、ZLG、RG组p-mTOR、p-4E-BP1、P62蛋白和mTOR、4E-BP1、P62的mRNA下调最显著(p＜0.05)；ZMG组Caspase9蛋白及其mRNA表达下调最明显(p＜0.01或p＜0.05)。
结论：
1.黄菟益肾方可以改善C-BSA大鼠的一般状态，降低尿蛋白，升高血浆蛋白，纠正脂代谢紊乱，对特发性膜性肾病有一定的治疗作用。
2.黄菟益肾方可上调足细胞Podocin、WT1蛋白的表达，改善C-BSA大鼠肾脏病理损伤，有效减缓了特发性膜性肾病的发展。
3.黄菟益肾方可下调C-BSA大鼠肾组织p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA的表达，提示其可能通过抑制mTOR/4E-BP1通路来增强足细胞自噬，减少足细胞凋亡，从而对C-BSA大鼠肾脏发挥保护作用。
方法：110只SPF级雄性SD大鼠随机抽取15只做为正常组(NG)。剩余95只采用C-BSA造模法制备特发性膜性肾病大鼠模型。造模成功后的大鼠随机分为6组：模型组(MG)、黄菟益肾方大剂量组(ZHG)，黄菟益肾方中剂量组(ZMG)、黄菟益肾方小剂量组(ZLG)，雷帕霉素组(RG)、贝那普利组(BG)。共给药干预4W。定期观察大鼠一般状态。2W末时，各组分别处死5只大鼠，余大鼠4W末处死。检测24h尿蛋白定量(24h-PRO)，血清生化指标(TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr)；光镜观察肾脏病理(Masson、PASM染色)；透射电镜观察肾小球超微结构、基底膜变化；免疫组化法检测肾组织Podocin、WT1蛋白表达。4W末时另用WesternBlot和Real-timePCR检测肾组织p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白和mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达。
结果：
1.黄菟益肾方对C-BSA大鼠一般状态的影响
NG大鼠精神状态佳，活泼好动。MG大鼠精神萎靡，消瘦明显，饮食及进水量、尿量明显减少，四肢、头面部肿胀，毛发暗黄无光泽。ZHG、ZMG、ZLG大鼠精神状态好转，饮食进水无异常，体重稍有降低，ZHG大鼠用药后尿量增多。RG大鼠治疗2W时精神好，毛色正常，活泼好动，但3W时活动量减少，多数大鼠逐渐消瘦。BG大鼠精神尚可，进水饮食正常，但大鼠懒动不活跃。
2.黄菟益肾方对C-BSA大鼠24h-PRO和血清生化指标的影响
与同时间点NG组比较，MG大鼠24h-PRO显著增加(p＜0.01)，TP、ALB显著下降(p＜0.01)，TC、TG升高显著(p＜0.01)，大鼠出现了肾病综合征，提示造模成功。BUN、Scr与NG无明显差异(p＞0.05)。治疗2W后，与同时间点MG比较，各治疗组大鼠的24h-PRO，TP、ALB均有不同程度的改善，但无统计学意义(p＞0.05)，各治疗组(除RG外)TC、TG均有不同程度的下降，RG组TC、TG稍有升高，但差异均不显著(p＞0.05)。治疗4W后，与同时间点MG相比，各治疗组24h-PRO显著减少(p＜0.01)，TP、ALB明显升高(p＜0.01)，ZHG、ZMG、ZLG、BG组TC、TG降低明显(p＜0.01或p＜0.05)，RG组TC、TG升高明显(p＜0.05)。各治疗组间24h-PRO、TC、TG降低，TP、ALB升高均以ZMG最为显著(p＜0.01或p＜0.05)。与2W末同组相比，除ZHG外，各治疗组24h-PRO均明显下降，TP、ALB升高显著(p＜0.01或p＜0.05)；ZMG、ZLG组TC、TG明显下降(p＜0.01或p＜0.05)，RG组TC、TG显著升高(p＜0.01)；上述指标尤以ZMG改善更为显著(p＜0.01)。
3.黄菟益肾方对C-BSA大鼠肾组织病理的影响
光镜下可见：NG大鼠肾小球正常，MG大鼠2W时可见嗜复红蛋白沉积于上皮细胞下，GBM增厚，肾小管上皮细胞可见空泡样改变；4W时肾小球病变较2W加重，基底膜进一步增厚，上皮下嗜复红蛋白沉积增多，并出现肾小球毛细血管襻狭窄、闭塞，系膜基质增多，不同程度的肾小管萎缩，肾间质炎性细胞浸润及肾小球硬化。各治疗组治疗2W时可见肾小球GBM增厚、嗜复红蛋白在上皮细胞下沉积，系膜区增生；但较MG减轻；治疗4W后，各治疗组肾脏损伤均较MG有不同程度的改善，尤其ZMG最为明显。
透射电镜下可见：NG大鼠GBM无增厚，未见电子致密物沉积，足突排列整齐、间隙均匀，足突端无融合、膨大。治疗2W后MG大鼠电镜下可见GBM弥漫性增厚，电子致密物沉积，足突膨大肿胀、融合形成钉突，足突间隙大小不等；各治疗组不同程度的GBM增厚，电子致密物沉积，足突膨大肿胀、融合，间隙大小不等，但较MG程度减轻。治疗4W后，各治疗组GBM增厚、电子致密物沉积及足细胞损伤情况均较MG有不同程度的改善，尤以ZMG改善最明显。
4.黄菟益肾方对C-BSA大鼠足细胞Podocin、WT1蛋白表达的影响
免疫组化法检测各组大鼠肾脏Podocin、WT1蛋白的表达，结果显示：与同时间点NG组比较，MG组Podocin、WT1蛋白表达下降(p＜0.01)，C-BSA大鼠出现了明显的足细胞损伤。治疗2W后，与同时间点MG相比，各治疗组Podocin、WT1蛋白表达稍有升高，但无统计学意义(p＞0.05)。治疗4W后，与同时间点MG相比,各治疗组Podocin、WT1蛋白表达显著升高(p＜0.01或p＜0.05)，各治疗组间以ZMG、RG升高最为显著(p＜0.01或p＜0.05)。与2W末同组相比，各治疗组除ZHG外Podocin、WT1蛋白表达均明显升高(p＜0.01或p＜0.05)；其中ZMG、RG升高最为显著(p＜0.01)。
5.黄菟益肾方对C-BSA大鼠p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达的影响
Westernblot与Real-timePCR结果显示：与NG相比，MG大鼠p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA表达显著上调(p＜0.01)。与MG相比，各治疗组上述蛋白和mRNA表达均明显下调(p＜0.01或p＜0.05)。各治疗组相比，ZMG、ZLG、RG组p-mTOR、p-4E-BP1、P62蛋白和mTOR、4E-BP1、P62的mRNA下调最显著(p＜0.05)；ZMG组Caspase9蛋白及其mRNA表达下调最明显(p＜0.01或p＜0.05)。
结论：
1.黄菟益肾方可以改善C-BSA大鼠的一般状态，降低尿蛋白，升高血浆蛋白，纠正脂代谢紊乱，对特发性膜性肾病有一定的治疗作用。
2.黄菟益肾方可上调足细胞Podocin、WT1蛋白的表达，改善C-BSA大鼠肾脏病理损伤，有效减缓了特发性膜性肾病的发展。
3.黄菟益肾方可下调C-BSA大鼠肾组织p-mTOR、p-4E-BP1、P62、Caspase9蛋白及mTOR、4E-BP1、P62、Caspase9的mRNA的表达，提示其可能通过抑制mTOR/4E-BP1通路来增强足细胞自噬，减少足细胞凋亡，从而对C-BSA大鼠肾脏发挥保护作用。