目的:Wnt1诱导信号通路蛋白1(WISP1)属于Cyr61-CTGF-Nov(CCN)家族蛋白,具有多种生物学功能,如参与细胞粘附、增殖、胚胎发育、血管形成等调控,同时其在肿瘤的发生及发展中也扮演着重要的角色。目前已有的研究显示,WISP1在很多人类肿瘤中表达异常,并与肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞的增殖潜能、组织侵犯、远处转移以及肿瘤患者的临床病理因素密切相关,使其成为肿瘤患者诊治及预后的潜在靶点。Ki67是目前作为细胞增殖活性高低的一种标志,广泛表达于除静止期(G0期)外的细胞周期的任何时期,其阳性表达与细胞增殖、周期进展及有丝分裂关系密切,是临床上常用来评估肿瘤增殖活性的重要生物指标。本研究选取手术切除的胃癌组织标本,运用免疫组织化学检测方法,评估WISP1和Ki67在胃癌组织及非癌胃粘膜组织中的表达情况,统计分析二者表达的相关性及其与胃癌临床病理因素的关系,并探讨其对胃癌发生、发展及预后的影响。材料与方法:1、临床标本及病理资料:收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除胃癌患者组织标本87例及其配对非癌(距癌灶边缘>5cm取材)胃粘膜组织80例。所有组织标本离体后尽快以10%中性福尔马林固定24-48小时,取材组织厚约2-3mm,脱水、透明、浸蜡,常规石蜡组织包埋,切片行HE染色,标记胃癌组织及正常胃黏膜组织,构建胃癌组织芯片,行4μm连续切片备用。收集患者的临床病理信息,包括性别、年龄、Borrmann分型、WHO组织学分型、Lauren分型、肿瘤大小等,TNM分期根据国际抗癌联盟UICC(Union for International Cancer Control)及美国联合癌症委员会AJCC(American Joint Committee on Cancer)胃癌TNM分期准则(第8版)划分,T代表原发肿瘤胃壁浸润深度情况,N代表胃癌患者区域淋巴结转移情况,M代表胃癌远处转移情况。2、免疫组织化学染色:采用p H 9.0 EDTA修复液修复WISP1抗原,PV9000两步法检测胃癌组织及非癌胃粘膜组织中WISP1蛋白表达。采用p H 6.0柠檬酸修复液高温高压修复Ki67抗原,免疫组织化学法检测胃癌组织中Ki67的表达。PBS替代一抗做阴性对照。3、免疫组织化学染色结果的判定:WISP1蛋白的免疫阳性反应为细胞质中呈现清晰的棕黄色颗粒,Ki67蛋白免疫阳性反应为细胞核中呈现清晰的棕黄色颗粒。免疫组织化学染色结果由两位经验丰富的病理医师判定,每一个病例选取2个视野,于高倍镜下计数200个细胞,根据同类细胞数中阳性细胞数所占的比例,进行等级评估。结果采用半定量计分方法,根据细胞染色强度(A)和阳性细胞所占的比例(B)两者乘积来判定。即:(A)-染色强度按下列标准评定记分:0分为无色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色;(B)-染色的阳性细胞所占比例按下列标准评定记分:0分为无阳性细胞或弱阳性细胞数<5%,1分为阳性细胞数占5%~25%,2分为阳性细胞数占26%~50%,3分为阳性细胞数占51%~75%,4分为阳性细胞数>75%。两种评分相乘(Ax B),将结果分为:0分为阴性(-),1-4分为弱阳性(+),5-8分为中度阳性(++),9-12分为强阳性(+++),最终将评分为“+~+++”的病例归为WISP1阳性组,评分“0”的病例归为阴性组。Ki67免疫组织化学染色结果按照阳性细胞在计数的同类细胞的百分比记录,分为Ki67阳性细胞数≤30%和Ki67阳性细胞数>30%两组。4、利用公共数据库GEO分析WISP1在胃癌组织中表达情况及其对患者预后的影响。5、统计学处理:运用SPSS 22.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)统计学软件进行实验结果的统计处理和分析,WISP1在胃癌组织及配对胃粘膜组织中的表达情况及其和Ki67与临床病理因素统计分析均采用χ2检验,两者相关性采用Kendall-taub相关性分析。显著性检验水准为α=0.05,P<0.05差异有统计学意义。实验结果:1、WISP1蛋白免疫阳性反应主要定位于细胞质。胃癌组织中WISP1的阳性表达率为81.61%(71/87),显著高于非癌胃粘膜组织阳性表达率12.50%(10/80),χ2=79.692,P=0.000。WISP1蛋白的阳性表达与胃癌肿瘤大小(χ2=6.649,P=0.010)、WHO组织学分型(χ2=18.061,P=0.006)、Lauren分型(χ2=16.909,P=0.000)、淋巴结转移(χ2=5.025,P=0.025)等病理因素相关,即随着管状腺癌分化程度的降低,WISP1的阳性表达增高,在低分化腺癌中WISP1的阳性表达较中(χ2=12.433,P=0.000)、高(Fisher精确检验,P=0.032)分化管状腺癌显著增高;在Lauren分型中,弥漫型胃癌组织中WISP1蛋白阳性表达较肠型胃癌患者中WISP1阳性表达显著增高,χ2=14.635,P=0.000;在肿瘤直径>5cm的胃癌组织中WISP1蛋白阳性率显著高于肿瘤直径≤5cm的胃癌组织(χ2=6.649,P=0.010);在伴有淋巴结转移的胃癌组织中,WISP1阳性表达显著高于无淋巴结转移组,差异具有统计学意义。WISP1蛋白表达与胃癌患者的性别、年龄、Borrmann分型、肿瘤浸润深度、远处转移及TNM分期均未见明显关联(P>0.05)。通过公共数据库GEO对可获得总体生存时间(OS)的631例患者和522例首次进展时间(FP)患者中WISP1表达情况进行分析,结果发现WISP1 m RNA高表达组患者生存时间较低表达组患者明显缩短。2、Ki67蛋白在胃癌组织中的阳性反应定位在细胞核。胃癌组织中Ki67阳性细胞数≤30%组有33例,Ki67阳性细胞数>30%组有54例,其表达与进展期胃癌患者肿瘤浸润深度(χ2=4.088,P=0.043)和淋巴结转移(χ2=4.882,P=0.027)相关;但与患者不同性别、年龄、Borrmann分型、WHO组织学分型、Lauren分型、肿瘤大小、远处转移及TNM分期等临床病理资料不相关。3、87例胃癌组织中WISP1的阳性表达与Ki67表达呈正相关,rk=0.240,P=0.026。4、在WISP1阳性表达且伴有Ki67阳性细胞数>30%表达的胃癌组织有48例,统计分析二者共同表达时与胃癌患者WHO组织学分型(χ2=11.102,P=0.049)、Lauren分型(χ2=9.822,P=0.007)、肿瘤大小(χ2=7.733,P=0.005)、淋巴结转移(χ2=7.011,P=0.008)有显著性差异,且二者共同表达较Ki67单独表达提高了淋巴结转移预测能力,更好的反应淋巴结转移情况。结论:1、胃癌组织中WISP1的表达较非癌胃粘膜组织显著上调,且在低分化腺癌中阳性率明显高于中、高分化管状腺癌,在弥漫型胃癌中的表达较肠型胃癌显著增高,在原发肿瘤直径>5cm的胃癌组织中阳性表达率显著高于直径≤5cm组,在有淋巴结转移组胃原发灶癌组织中其表达较无淋巴结转移显著增高,提示WISP1可能作为原癌基因在胃癌演进过程中发挥重要的作用;2、与蛋白水平表达研究结果相同,在m RNA水平上,WISP1在胃癌组织中表达显著增高,其表达与胃癌患者预后明显相关;3、胃癌组织中Ki67阳性细胞数>30%的患者与肿瘤浸润深度、淋巴结转移等临床病理因素相关,但与其他病理因素无明显相关;4、在胃癌组织中WISP1和Ki67表达呈正相关关系,当WISP1阳性表达且Ki67阳性细胞数>30%时,统计分析发现,二者共同表达与胃癌患者WHO组织学分型、Lauren分型、肿瘤大小及淋巴结转移等临床病理资料密切相关,两者联合检测可更好的预测出胃癌淋巴结转移情况,但其相关分子机制仍有待于进一步深入研究。