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目的：
宫颈癌发病率居女性癌症人数的第二位，仅次于乳腺癌，具有较高的发病率和死亡率。寻找新的治疗靶点和预后标志物是提高宫颈癌患者生存率的迫切需要。许多长非编码RNAs(lncRNAs)是各种生物过程中的关键调节器，它们的异常表达与宫颈癌进展的密切相关。
近年来，随着小非编码RNA研究的深入以及人类基因组学的不断发展、完善，大量长片段的非编码RNA通过深度测序及高通量芯片技术被人们所发现，他们在生命活动中的重要意义也逐渐得到揭示。长链非编码RNA(LncRNAs)，是一类可以像mRNA一样具有多聚腺苷酸化、转录本长度从200nt一直到100kb的细胞内源性RNA分子，不具备编码蛋白的能力，却参与了例如染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调控等多种十分重要的生命活动调控过程。研究发现，LncRNAs在多种类型肿瘤细胞（包括现宫颈癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等）的增殖、克隆、调亡、侵袭、转移及耐药等方面均发挥着重要的作用。更全面、更深刻地阐明LncRNAs在人类疾病尤其是肿瘤中的功能和机制，将会对肿瘤的早期诊断、预后判断、以及临床个性化治疗上提供更大的帮助。
HOXD是同源异型盒(Hox)基因家族的成员，在胚胎和器官的发育过程中起着至关重要的作用。HOXD簇反义RNA1(HOXD-AS1)是一种新的LncRNA，以反义方式从人染色体2q31.2上的HOXD基因簇中转录。越来越多的证据表明，HOXD-AS1的异位表达参与多种类型的人类肿瘤的发生和进展，包括肝细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和胃癌等。但HOXD-AS1与宫颈癌的关系目前还不明确。
通过检索非编码RNA基因的综合数据平台NONCODE科学数据库(http：//www.Noncode.org/)，发现HOXD-AS1是一种与宫颈组织相关的异常表达的LncRNAs。鉴于此，把HOXD-AS1作为研究对象，通过检测宫织及细胞中的HOXD-AS1表达水平判断HOXD-AS1与宫颈癌的关系，并且通过后续的体外实验探讨HOXD-AS1在宫颈癌中的具体作用及其作用机制。
方法：
1.组织标本的收集
从2013-2015年之间海军总医院及内蒙古自治区人民医院医院采集的宫颈癌手术标本共122个患者，样本切除后置于冻存管中，标注样本信息后置于液氮中保存，整个保存及转运过程中按照无酶的原则进行操作。这些病例术前未实施过化疗、放疗及向治疗等。详细的病理特征和临床数据通过回顾性分析完整存档病史获得，包括年龄，组织类型，分化程度，临床分期，是否淋巴脉管间隙浸润，有无淋巴结转移等，病历信息完整。通过随访确定患者是否能复发。标本的获取和操作符合临床实验的伦理规范及操作规程。
2.细胞系及培养方法
五种宫颈癌细胞系(HeLa,CaSki,ME-100，C33A and SiHa)和正常人宫颈细胞系HOSE均从美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA，USA)获得，由本实验室培养及传代保存。细胞在含有10％胎牛血清和100UI/mL青霉素和100ug/mL链球菌酶的RPMI-1640培养基中培养。接种50mL的细胞培养瓶在37℃下用5％CO2在培养箱中培养。
3.实时荧光定量PCR
将组织样本和细胞样本采用Trizol法提取RNA。采用RT-PCR试剂盒（Takara公司），按说明书要求将RNA反转录为cDNA。从TaKaRa获得了hoxdas1和U6引物序列，U6作为内参，按20ul体系配制成混合液后，置于ABI7500仪器运行，检测宫颈组织及五种宫颈癌细胞和正常人宫颈细胞系的hoxd-as1表达。取3次独立实验所得数据均数为结果。
4.siRNA及minics脂质体法转染宫颈癌细胞
针对HOXD-AS1的siRNA（hoxd-assiRNA1和HOXD-AS1siRNA2）和HOXD-AS1minics和阴性对照组（对照组）都从吉玛制药有限公司获得（上海，中国）。细胞粘附在六孔板后，使用脂质体(Lipofectamine2000)分别对HeLa和CaSki细胞进行转染。按照预先设定分组，RT-PCR检测HOXD-AS1表达情况，进行后续实验。
5.细胞增殖能力检测
将细胞接种于96孔板上，对细胞进行特定的干预，转染后6hrs、12hrs、24hrs、48hrs和72hrs，用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测细胞增殖能力。在酶联免疫仪上选择450nm波长测定各组样品吸光值，绘制生长曲线。
6.平板克隆实验
取对数生长期细胞，接种于6孔板，接种14天后观察，当肉眼可见细胞克隆时终止实验，用0.1％结晶紫染色，计算克隆形成率。
7.细胞划痕实验
细胞转染24小时后，待细胞生长至100％汇合时，用枪头垂直在平板上划线。把脱落的细胞冲洗干净，37培养基培养24小时，每6h显微镜下检测一次，并拍照记录，计算细胞生长覆盖区面积比。
8.体外侵袭实验
转染24h后，用膜酶消化并制成单个细胞悬液，于每孔1×105个细胞的密度接种于Transwell用的24孔板的上室，在24孔板中每孔加入200ul悬浮液。在孔的下一个腔室中加入500ul培养基，培养24h后，0.1％结晶紫染色。正向显微镜观察并拍摄细胞贴附于Transwell室基底膜的情况。选择5个随机视野进行计数，计算细胞侵袭率。
9.West blotting法
细胞/组织蛋白提取后，BCA法测蛋白浓度。配10％分离胶行SDS-PAGS电泳，转膜后依次孵育一抗、二抗。将胶片扫描，用凝胶图像处理系统分析目的条带光密度值及分子量，完成统计分析。
10.裸鼠成瘤实验
将转染siRNA的HeLa细胞作为处理组，未经处理的hela细胞作为对照组，制成细胞浓度在5×107/ml的悬液，注射在4周龄的BALB/C裸鼠腋窝后方皮下，每只裸鼠接种0.2ml。成瘤后隔天应用游标卡尺测量肿瘤的长径及短径，28天后将裸鼠处死，解剖取出肿瘤，电子称称重，对比两组实验裸鼠体内成瘤的重量和肿瘤体积。
结果：
1.RT-PCR检测组织结果：通过对122例宫颈癌细胞标本hoxd-as1表达的检测，发现宫颈癌患者hoxd-as1表达水平与肿瘤淋巴结转移、临床分期、脉管侵犯、淋巴结转移以及肿瘤复发相关(P＜0.05)。与年龄、组织分化(P＞0.05)等方面无明显相关性。
2.RT-PCR检测细胞结果：荧光定量PCR检测通过实时荧光定量PCR检测五种宫颈癌细胞(HeLa，CaSki，ME-100，C33A and SiHa)和正常人宫颈细胞系HOSE的hoxd-as1表达。发现宫颈癌细胞表达比正常宫颈细胞更高的hoxd-as1水平(P＜0.01)。其中上皮宫颈癌(Hela)、表皮样囊肿宫颈癌在小肠系膜转移细胞(CaSki)表达的hoxd-as1水平相对较高。
3.分别下调和上调宫颈癌细胞hoxd-as1的表达后，对细胞增值速度、自我更、迁移和侵袭能力的影响。通过转染hoxd-as1siRNA下调宫颈癌细胞hoxd-as1的表达后，MTT实验和划痕实验、Transwell细胞迁移和细胞侵袭实验证明，下调hoxd-as1表达能够降低宫颈癌细胞的增值速度、自我更、迁移和侵袭能力。而上调hoxd-as1的表达后宫颈癌细胞的增值速度、自我更、迁移和侵袭能力增强。
4.West blotting实验，结果发现下调hoxd-as1的表达后宫颈癌细胞的p-ERK和Ras蛋白水平明显下降。而上调hoxd-as1的表达后，p-ERK和Ras蛋白水平明显升高。
5.ERK1/2抑制剂对上调hoxd-as1的表达细胞的影响：在上调hoxd-as1表达后，使用ERK1/2抑制剂抑制Ras/ERK1/2通路的激活，结果显示使用ERK1/2抑制剂作用后，这种hoxd-as1minics促进的颈癌细胞的增值、迁移和侵袭能力被明显抑制。
6.裸鼠成瘤实验：hoxd-as1siRNA处理后的宫颈癌细胞种入裸鼠体内后成瘤的体积和重量均明显小于被对照组(P＜0.01)。
7.鼠体内成瘤的肿瘤组织的ERK1/2和Ras蛋白水平：通过western blot实验和免疫组化发现，下调hoxd-as1的表达能够显著抑制裸鼠体内成瘤的肿瘤组织的ERK1/2和Ras蛋白水平(P＜0.01)。
结论：
1.宫颈癌患者hoxd-as1表达水平与肿瘤临床分期、脉管侵犯、淋巴结转移以及肿瘤复发正相关。
2.上调宫颈癌细胞hoxd-as1表达能够促进其增值、自我更新、迁移和侵袭能力;下调hoxd-as1的表达能够抑制宫颈癌细胞的增值、自我更新、迁移和侵袭能力。
3.hoxd-as1通过ERK/Ras通路影响了促进宫颈癌细胞增值、自我更新、迁移和侵袭能力。
4..下调宫颈癌细胞的hoxd-as1表达能够抑制其在裸鼠体内成瘤，其作用是通过ERK/Ras信号通路实现的，与体外细胞实验结果相一致。
宫颈癌发病率居女性癌症人数的第二位，仅次于乳腺癌，具有较高的发病率和死亡率。寻找新的治疗靶点和预后标志物是提高宫颈癌患者生存率的迫切需要。许多长非编码RNAs(lncRNAs)是各种生物过程中的关键调节器，它们的异常表达与宫颈癌进展的密切相关。
近年来，随着小非编码RNA研究的深入以及人类基因组学的不断发展、完善，大量长片段的非编码RNA通过深度测序及高通量芯片技术被人们所发现，他们在生命活动中的重要意义也逐渐得到揭示。长链非编码RNA(LncRNAs)，是一类可以像mRNA一样具有多聚腺苷酸化、转录本长度从200nt一直到100kb的细胞内源性RNA分子，不具备编码蛋白的能力，却参与了例如染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调控等多种十分重要的生命活动调控过程。研究发现，LncRNAs在多种类型肿瘤细胞（包括现宫颈癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等）的增殖、克隆、调亡、侵袭、转移及耐药等方面均发挥着重要的作用。更全面、更深刻地阐明LncRNAs在人类疾病尤其是肿瘤中的功能和机制，将会对肿瘤的早期诊断、预后判断、以及临床个性化治疗上提供更大的帮助。
HOXD是同源异型盒(Hox)基因家族的成员，在胚胎和器官的发育过程中起着至关重要的作用。HOXD簇反义RNA1(HOXD-AS1)是一种新的LncRNA，以反义方式从人染色体2q31.2上的HOXD基因簇中转录。越来越多的证据表明，HOXD-AS1的异位表达参与多种类型的人类肿瘤的发生和进展，包括肝细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和胃癌等。但HOXD-AS1与宫颈癌的关系目前还不明确。
通过检索非编码RNA基因的综合数据平台NONCODE科学数据库(http：//www.Noncode.org/)，发现HOXD-AS1是一种与宫颈组织相关的异常表达的LncRNAs。鉴于此，把HOXD-AS1作为研究对象，通过检测宫织及细胞中的HOXD-AS1表达水平判断HOXD-AS1与宫颈癌的关系，并且通过后续的体外实验探讨HOXD-AS1在宫颈癌中的具体作用及其作用机制。
方法：
1.组织标本的收集
从2013-2015年之间海军总医院及内蒙古自治区人民医院医院采集的宫颈癌手术标本共122个患者，样本切除后置于冻存管中，标注样本信息后置于液氮中保存，整个保存及转运过程中按照无酶的原则进行操作。这些病例术前未实施过化疗、放疗及向治疗等。详细的病理特征和临床数据通过回顾性分析完整存档病史获得，包括年龄，组织类型，分化程度，临床分期，是否淋巴脉管间隙浸润，有无淋巴结转移等，病历信息完整。通过随访确定患者是否能复发。标本的获取和操作符合临床实验的伦理规范及操作规程。
2.细胞系及培养方法
五种宫颈癌细胞系(HeLa,CaSki,ME-100，C33A and SiHa)和正常人宫颈细胞系HOSE均从美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA，USA)获得，由本实验室培养及传代保存。细胞在含有10％胎牛血清和100UI/mL青霉素和100ug/mL链球菌酶的RPMI-1640培养基中培养。接种50mL的细胞培养瓶在37℃下用5％CO2在培养箱中培养。
3.实时荧光定量PCR
将组织样本和细胞样本采用Trizol法提取RNA。采用RT-PCR试剂盒（Takara公司），按说明书要求将RNA反转录为cDNA。从TaKaRa获得了hoxdas1和U6引物序列，U6作为内参，按20ul体系配制成混合液后，置于ABI7500仪器运行，检测宫颈组织及五种宫颈癌细胞和正常人宫颈细胞系的hoxd-as1表达。取3次独立实验所得数据均数为结果。
4.siRNA及minics脂质体法转染宫颈癌细胞
针对HOXD-AS1的siRNA（hoxd-assiRNA1和HOXD-AS1siRNA2）和HOXD-AS1minics和阴性对照组（对照组）都从吉玛制药有限公司获得（上海，中国）。细胞粘附在六孔板后，使用脂质体(Lipofectamine2000)分别对HeLa和CaSki细胞进行转染。按照预先设定分组，RT-PCR检测HOXD-AS1表达情况，进行后续实验。
5.细胞增殖能力检测
将细胞接种于96孔板上，对细胞进行特定的干预，转染后6hrs、12hrs、24hrs、48hrs和72hrs，用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测细胞增殖能力。在酶联免疫仪上选择450nm波长测定各组样品吸光值，绘制生长曲线。
6.平板克隆实验
取对数生长期细胞，接种于6孔板，接种14天后观察，当肉眼可见细胞克隆时终止实验，用0.1％结晶紫染色，计算克隆形成率。
7.细胞划痕实验
细胞转染24小时后，待细胞生长至100％汇合时，用枪头垂直在平板上划线。把脱落的细胞冲洗干净，37培养基培养24小时，每6h显微镜下检测一次，并拍照记录，计算细胞生长覆盖区面积比。
8.体外侵袭实验
转染24h后，用膜酶消化并制成单个细胞悬液，于每孔1×105个细胞的密度接种于Transwell用的24孔板的上室，在24孔板中每孔加入200ul悬浮液。在孔的下一个腔室中加入500ul培养基，培养24h后，0.1％结晶紫染色。正向显微镜观察并拍摄细胞贴附于Transwell室基底膜的情况。选择5个随机视野进行计数，计算细胞侵袭率。
9.West blotting法
细胞/组织蛋白提取后，BCA法测蛋白浓度。配10％分离胶行SDS-PAGS电泳，转膜后依次孵育一抗、二抗。将胶片扫描，用凝胶图像处理系统分析目的条带光密度值及分子量，完成统计分析。
10.裸鼠成瘤实验
将转染siRNA的HeLa细胞作为处理组，未经处理的hela细胞作为对照组，制成细胞浓度在5×107/ml的悬液，注射在4周龄的BALB/C裸鼠腋窝后方皮下，每只裸鼠接种0.2ml。成瘤后隔天应用游标卡尺测量肿瘤的长径及短径，28天后将裸鼠处死，解剖取出肿瘤，电子称称重，对比两组实验裸鼠体内成瘤的重量和肿瘤体积。
结果：
1.RT-PCR检测组织结果：通过对122例宫颈癌细胞标本hoxd-as1表达的检测，发现宫颈癌患者hoxd-as1表达水平与肿瘤淋巴结转移、临床分期、脉管侵犯、淋巴结转移以及肿瘤复发相关(P＜0.05)。与年龄、组织分化(P＞0.05)等方面无明显相关性。
2.RT-PCR检测细胞结果：荧光定量PCR检测通过实时荧光定量PCR检测五种宫颈癌细胞(HeLa，CaSki，ME-100，C33A and SiHa)和正常人宫颈细胞系HOSE的hoxd-as1表达。发现宫颈癌细胞表达比正常宫颈细胞更高的hoxd-as1水平(P＜0.01)。其中上皮宫颈癌(Hela)、表皮样囊肿宫颈癌在小肠系膜转移细胞(CaSki)表达的hoxd-as1水平相对较高。
3.分别下调和上调宫颈癌细胞hoxd-as1的表达后，对细胞增值速度、自我更、迁移和侵袭能力的影响。通过转染hoxd-as1siRNA下调宫颈癌细胞hoxd-as1的表达后，MTT实验和划痕实验、Transwell细胞迁移和细胞侵袭实验证明，下调hoxd-as1表达能够降低宫颈癌细胞的增值速度、自我更、迁移和侵袭能力。而上调hoxd-as1的表达后宫颈癌细胞的增值速度、自我更、迁移和侵袭能力增强。
4.West blotting实验，结果发现下调hoxd-as1的表达后宫颈癌细胞的p-ERK和Ras蛋白水平明显下降。而上调hoxd-as1的表达后，p-ERK和Ras蛋白水平明显升高。
5.ERK1/2抑制剂对上调hoxd-as1的表达细胞的影响：在上调hoxd-as1表达后，使用ERK1/2抑制剂抑制Ras/ERK1/2通路的激活，结果显示使用ERK1/2抑制剂作用后，这种hoxd-as1minics促进的颈癌细胞的增值、迁移和侵袭能力被明显抑制。
6.裸鼠成瘤实验：hoxd-as1siRNA处理后的宫颈癌细胞种入裸鼠体内后成瘤的体积和重量均明显小于被对照组(P＜0.01)。
7.鼠体内成瘤的肿瘤组织的ERK1/2和Ras蛋白水平：通过western blot实验和免疫组化发现，下调hoxd-as1的表达能够显著抑制裸鼠体内成瘤的肿瘤组织的ERK1/2和Ras蛋白水平(P＜0.01)。
结论：
1.宫颈癌患者hoxd-as1表达水平与肿瘤临床分期、脉管侵犯、淋巴结转移以及肿瘤复发正相关。
2.上调宫颈癌细胞hoxd-as1表达能够促进其增值、自我更新、迁移和侵袭能力;下调hoxd-as1的表达能够抑制宫颈癌细胞的增值、自我更新、迁移和侵袭能力。
3.hoxd-as1通过ERK/Ras通路影响了促进宫颈癌细胞增值、自我更新、迁移和侵袭能力。
4..下调宫颈癌细胞的hoxd-as1表达能够抑制其在裸鼠体内成瘤，其作用是通过ERK/Ras信号通路实现的，与体外细胞实验结果相一致。