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脓毒症(sepsis)是病原微生物入侵机体引发的失调控的全身炎症反应,已经成为重症监护病房患者死亡的主要疾病。脓毒症常并发器官功能障碍,重症脓毒症患者和脓毒症休克患者病死率高达30%～50%以上。拮抗脂多糖、调控炎症反应、抗凝和抗氧化应激治疗并没有明显改善脓毒症的预后,触发我们重新思考脓毒症的发病机制。近年的研究表明免疫抑制在脓毒症的发病机制中可能发挥更重要的作用。在脓毒症患者中,先天固有免疫和后天获得性免疫功能发生严重抑制,免疫细胞清除入侵病原微生物能力下降,抗生素并不能有效控制体内感染灶形成。巨噬细胞作为机体免疫防御的第一道防线的主要组分,在吞噬清除病原微生物方面发挥不可替代的功能。近年来国内外的研究表明,脓毒症患者的巨噬细胞功能发生严重下降,从而导致细菌大量繁殖。瞬时受体电位通道M2(Transient Receptor Potential Melastatin2, TRPM2)是非选择性钙离子通道,在巨噬细胞表面呈固有表达,且脂多糖(LPS)可以明显上调其表达水平。研究表明,TRPM2在巨噬细胞介导炎症反应和吞噬病原微生物方面等功能中发挥重要作用。基因敲除TRPM2可以明显降低巨噬细胞炎症因子的产生和巨噬细胞的吞噬功能。这些研究提示TRPM2可能通过调节巨噬细胞的功能,从而在脓毒症的发病机制中发挥重要功能。然而,TRPM2在脓毒症中的作用和机制仍不清楚。亚铁血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)是一种保守的应激反应酶,在抗炎、抗应激反应和抗凋亡作用中发挥重要作用。HO-1还可以增加吞噬细胞的杀菌能力,在脓毒症中发挥重要的保护作用。近年来的研究表明,钙离子内流对HO-1的表达有重要影响。因此,我们推测TRPM2介导的钙离子内流可能影响HO-1表达,从而调节巨噬细胞的杀菌能力；TRPM2可能通过调节HO-1增强杀菌作用在脓毒症中发挥一定的保护作用。本研究的目的旨在阐述TRPM2对原代体外培养巨噬细胞杀菌能力的影响和盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症模型小鼠体内细菌清除及其机制进行研究,揭示TRPM2在脓毒症发病机制中可能存在的作用。同时,本研究观察了脓毒症患者外周血单核细胞TRPM2和HO-1基因表达之间相关性及其对脓毒症患者预后的影响。本研究成果将阐明TRPM2在脓毒症发生发展中的作用及机制,完善脓毒症的发病机制研究,并为脓毒症的防治提供新的分子靶点。第一部分瞬时受体电位通道M2对小鼠巨噬细胞杀菌能力的影响及其机制研究目的：阐明瞬时受体电位通道M2(TRPM2)在巨噬细胞杀菌功能中的作用,初步探索TRPM2影响巨噬细胞杀菌功能的可能机制。方法：培养并收集TRPM2基因敲除(Trpm2-KO)小鼠和野生型(WT)小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),100mg/ml终浓度脂多糖(LPS)刺激BMDMs12h,观察亚铁血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)的诱导表达变化；并采用电生理、细胞内钙离子(ca2＋)浓度和免疫印迹等检测,初步探索TRPM2对HO-1表达影响的机制；使用离体杀菌实验研究TRPM2对巨噬细胞杀菌能力的影响和可能机制。结果：WT BMDMs在LPS刺激下产生典型特征性的TRPM2电流,而Trpm2-KO BMDMs在LPS刺激下无明显典型特征性的TRPM2电流产生。LPS刺激12h后,Trpm2-KO BMDMs的HO-1表达水平显著低于WT BMDMs (P<0.01).钙离子螯合剂可以剂量依赖性降低LPS刺激WT BMDMs的HO-1表达。Trpm2-KO BMDMs细胞内Ca2+浓度在LPS刺激后1、2、12和24h显著低于WT BMDMs. Trpm2-KO BMDMs杀菌能力明显低于WT BMDMs(P<0.05)。HO-1诱导剂Hemin预处理能显著增加LPS刺激下WT BMDMs的HO-1表达并明显增加WT BMDMs杀菌能力(P<0.001)。HO-1诱导剂Hemin预处理也能显著增加LPS刺激下Trpm2-KO BMDMs的HO-1表达并明显增加Trpm2-KO BMDMs杀菌能力(P<0.01)。结论：TRPM2介导的钙离子内流在LPS刺激巨噬细胞HO-1的表达中发挥重要作用。TRPM2可能是通过调节HO-1的表达影响巨噬细胞的杀菌能力。第二部分瞬时受体电位通道M2在脓毒症中的作用及机制研究目的：阐明瞬时受体电位通道M2(TRPM2)在脓毒症中的作用及其分子机制方法：使用盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症小鼠模型,通过对比野生(WT)小鼠和TRPM2基因敲除(Trpm2-KO)小鼠死亡率、细菌负荷、器官损伤、全身炎症反应和腹腔巨噬细胞亚铁血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)表达水平等,明确TRPM2在脓毒症发生发展中的作用。通过观察HO-1诱导剂对WT小鼠和Trpm2-KO小鼠CLP术后体内细菌清除率、死亡率、器官损害和全身炎症反应的影响,从而初步明确RPM2可能通过调控HO-1表达抑制脓毒症小鼠体内细菌繁殖并对保护脓毒症起到保护作用。结果：Trpm2-KO小鼠7天生存率明显低于WT小鼠(P<0.05)。CLP术后24h,Trpm2-KO小鼠体内细菌负荷、器官损害和全身炎症反应均明显高于WT小鼠。上调腹腔巨噬细胞HO-1可以增加WT小鼠CLP术后杀菌能力。与野生小鼠相比,Trpm2-KO小鼠CLP术后腹腔巨噬细胞HO-1的表达明显下降(P<0.05)。HO-1诱导剂可以显著增加Trpm2-KO小鼠CLP术后腹腔巨噬细胞HO-1的表达(P<0.05),并增强Trpm2-KO小鼠CLP术后体内细菌清除,从而降低死亡率、全身炎症反应及器官损伤。结论：TRPM2可能是通过调节巨噬细胞HO-1的表达抑制脓毒症细菌繁殖,从而在脓毒症中发挥重要的保护作用。第三部分瞬时受体电位通道M2和亚铁血红素加氧酶-1在脓毒症病人外周血单核细胞中的表达目的：测定脓毒症患者外周血单核细胞瞬时受体电位通道M2(TRPM2)和亚铁血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)基因表达的水平并分析两者的相关性,进一步探讨TRPM2和HO-1基因表达水平和患者临床预后的相关性。方法：通过分离脓毒症患者外周血单核细胞,使用定量PCR检测TRPM2和HO-1mRNA水平。记录脓毒症患者一般资料、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分和30天死亡率。结果：重度脓毒症或脓毒症休克组和非脓毒症组病人两组间年龄、性别和ICU住院时间无明显差异。重度脓毒症或脓毒症休克组APACHE Ⅱ评分(P=0.001),SOFA评分(P<0.05)和28天死亡率(P<0.05)高于非脓毒症组。定量PCR结果显示非存活脓毒症患者单核细胞TRPM2mRNA表达低于非脓毒症患者(P<0.05)或存活脓毒症患者(P=0.001)。非存活脓毒症患者单核细胞HO-1mRNA表达也低于非脓毒症患者(P<0.05)或存活脓毒症患者(P<0.05)。存活的脓毒症患者单核细胞TRPM2和HO-1mRNA表达和非脓毒症患者相比无明显差异。TRPM2和HO-1m] WA呈现高度相关性(r=0.675,P=0.001)。结论：TRPM2和HO-1基因表达低的患者更容易死亡。脓毒症患者单核细胞TRPM2和HO-1mRNA呈现高度相关性。